Автореферат (1150302), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Электрофореграмма смеси белков намодифицированном Cu+2-PEI-Mal структура В(4:1, мольн.) капилляре.Условия: система КЭ «КАПЕЛЬ 105М», 210 нм,20кВ; ввод пробы 2с 30 мбар. Фоновый электролит100 мМ фосфатный буферный раствор (рН = 2).Lis-лизоцим, Myo-миоглобин, Alb-альбумин, Trfтрансферин.Таблица 4. Условия on-line концентрирования, пределы обнаружения и факторы концентрированиябелков на модифицированных капиллярах.КапиллярCu2+полимер B(Mal),(4:1, мольн.)Cu2+полимер C(Mal),(3:1, мольн.)СпособконцентрированияУсловияСтэкинг сусилением поля сводной пробкойМатрица пробы - вода,гидродинамическийввод воды (30 мбар 60с)гидродинамическийввод пробы(30 мбар, 2 с),Стэкинг с большимобъемом вводимойпробыМатрица пробы – вода,гидродинамическийввод пробы(30 мбар, 40 с)13АналитыLisAlbMyoSEFhTrf1,11,11,11,2ПО, мкг/мл11,630,133,258,9SEFh45,234,739,148,2ПО, мкг/мл0,52,41,81,0Весь цикл проведенных исследований позволил перейти к анализу реальныхобъектов: образцы плазмы крови (определение альбумина) и слюны (определениелизоцима).
Применение стэкинга с большим объемом вводимой пробы намодифицированном капилляре обеспечило идентификацию лизоцима, содержаниекоторого в слюне – 1-40 мкг/мл, что значительно ниже минимальных значений,детектируемых классическим КЗЭ. Найденные концентрации: Alb = 50 ± 5 мг/мл, Liz =20±1 мкг/мл (P=0,95, n=3). Правильность результатов оценивалась методом «введенонайдено».Наличие множества хиральных центров в оболочке полимера и высокая плотностьтерминальных олигосахаридных групп указывает на возможность применения изучаемыхСРП в роли хиральных селекторов.
В качестве модельных систем взяты β-блокаторы(соталол, карведилол, пропранолол). Показано, что модификация силикагеля в ВЭТСХполимерами обеспечивает высокие факторы энантиоселективности, значения которыхзависят от природы (Mal или Lac) и содержания олигосахаридов в оболочке (структура А,В и или С) (табл.5).Таблица.5. Условия, значения 2Rf и энантиоселективность при разделении энантиомеров βблокаторов.β-блокаторПодвижная фазаМодификаторстационарнойфазы (2мг/мл)SR2RfαПропранололMeCN:MeOH(7:3, объемн.)PEI-Lac-APEI-Mal-A0,34±0,020,29±0,010,93±0,030,95±0,0226,037,0СоталолCH3CN:MeOH(7:1,5,объемн.)PEI-Lac-A0,22±0,010,79±0,0313,0КарведилолEtOH:MeCN (7:3;объемн.) + L-Pro(3,4 % масс.)PEI-Lac-APEI-Lac-C0,94±0,020,94±0,010,99±0,020,97±0,011,71,92гдеRf - фактор удерживания при двукратном проявлении с поворотом пластины на 90°, 2Rf = 1 - (1 - Rf )2,α – коэффициент энантиоселективности: α = [(1/Rf1) − 1]/[(1/Rf2) − 1].Максимальная энантиоселективность (α = 37)достигается для полимеров А (наибольшая40αMal Lac замещенностьолигосахаридами)(рис.12),30превышающая в 4-5 раз соответствующие значениядля β-циклодекстрина (β-ЦД), взятого для сравнения20в качестве хирального селектора (Табл.6).10Разделениеэнантиомеровкарведилоладостигнуто лишь при совместном присутствии двух0хиральныхселекторов: СРП - в составеABCстационарной фазы и L-пролина – в элюенте (α =Рис.12.Зависимостьфакторов1,9) (рис.13), что может быть обусловленоэнантиоселективностиотприродыполимеров (Mal или Lac оболочка,появлением дополнительных хиральных центров иструктура полимера А, В или С)образованием водородных связей с участием Lпролина.
Проведен анализ энантиомерного составалекарственных препаратов:«Акридилол» и «Анаприлин». Полученное соотношение масс энантиомеров сопоставимо,что и соответствует их содержанию в рацемической смеси.14Таблица 6. Сравнение значений факторов энантиоселективности пропранолола и соталола прииспользовании хиральных селекторов: β-ЦД, введенного в элюент, и PEI-Lac-A в составе стационарнойфазы.Подвижная фазаХиральныйселекторαПропранололСоталолДМФА:BuOH:MeCO2Et(3:5:5, объемн.,)β-CD (1мМ)β-CD (4мМ)2,62,42,92,1ДвукратноеMeCN:MeOH (7:1,5,объемн.,)PEI-Lac-A (мг/мл)1,2218,426,010,013,1ДвукратноеСпособпроявленияРис.13. Денситограммы карведилола.Элюент: С2Н5OH:СН3CN (7:3,объемн.,)+ L-Pro (1,7% масс.,); стационарнаяфаза: силикагель, модифицированныйPEI-Lac-C5kDa(10мг/мл);Аоднократное, Б–двукратное проявление.В третьем разделе 4-ой главы описывается применение высокофторированныхполимеров с ионогенными группами в методах ГЖХ, ВЭТСХ и КЭ.
Описанные вышеполимерные модификаторы – наноанионит и СРП – прекрасно зарекомендовали себя вкачестве покрытий стенок кварцевого капилляра в КЭ.Тем не менее, ни тот, ни другой из исследуемых модификаторов не способенпроявлять свойств мицеллоподобных псевдостационарных фаз из-за отсутствиядоступных аналитам гидрофобных полостей. В этом плане особый интерес представляютвысокофторированные полимеры, которые могут оказаться альтернативой широкоприменяемым в электрофорезе ПАВ для разделения нейтральных аналитов.
Большинствопубликацийпосвященополучениюфторированных сорбентовдля ВЭЖХ.Нерастворимость фторполимеров в воде и углеводородных растворителях ограничиваетих применение в качестве добавок в фоновый электролит и элюент.Нами синтезированы фторполимеры сополимеры фтормономеров с различнойфункциональностью (рис.14) и этилена.Дляувеличения растворимости ипримененияфторполимероввхроматографиииКЭпроведеныполимераналогичныепревращения:сульфонилфторидные группы переведеныРис.14. Функциональные мономеры дляв сульфонатные ив сульфамидные,фторполимеров.фторсульфатныезамененыкарбоксилатными, сложноэфирные переведены в N,N-диэтилкарбоксамидные и, наконец,N,N-диэтилкарбоксамидные восстановлены до амино- групп.
Таким образом, полученалинейка из пяти высокофторированных сополимеров (рис.15), отличающихся как длинойперфторированных подвесок к главной цепи полимеров, так и типом терминальных групп.На основе этих полимеров подготовлены насадочные колонки для ГЖХ и определеныиндексы удерживания Ковача.
Синтезированные полимеры проявили склонность к15гидрофобным, диполь-дипольным и электростатическим взаимодействиям, а такжеобразованию водородных связей с аналитами. Это позволило сделать прогноз навозможность электрофоретических и хроматографических экспериментов с их участиемпри разделении аналитов гидрофильной и гидрофобной природы (стероидные гормоны,водорастворимые витамины, аминокислоты).Установлено,чтовведенные в состав элюента(ВЭТСХ) фторполимеры взависимости от природытерминальных групп могутпроявлятьразличныесорбционные свойства.
Так,полимерФП-SO3-N(Et)4+,скорее всего, модифицируетсиликагель гидрофобнымифрагментамимолекулы(перфторированныеполиэфирныецепи),врезультате чего поверхностьсорбента становится болеегидрофильнойзасчетформирующихсянаповерхности отрицательно заряженных сульфонатных групп. Модификация силикагеляфторполимером с сульфамидными группами (ФП-SO2NH2), напротив, увеличиваетгидрофобность неподвижной фазы. При этом введение в элюент полимеров ФП-SO3N(Et)4+ и ФП-SO2NH2 способствует росту эффективности при разделении аминокислот(рис.16).Рис.15.
Схемы полимераналогичных превращений функциональныхгрупп полимеров.Таблица.7. Значение μЭОП, генерируемогофторполимерами с анионными группамиРис. 16. Зависимость эффективности при разделенииаминокислот от типа функциональных группфторированного полимера (3,2 мг/мл), введенного всостав элюента (CH3CN –HCOOH 4:1 объемн.),(P=0,95, n=3).В КЭ ионогенные фторполимеры могут какмодифицироватьстенкикварцевогокапилляра, так и выступатьв качествепсевдостационарнойфазы.Например,добавка в фоновый электролит(рН 2)фторполимеров с карбоксилатными исульфонатными группами (>1,5 мг/мл)обеспечила генерацию катодного ЭОП, чегоне наблюдалось в случае ДДСН (табл.7).16Фторполимер с сульфамидными группами не является ионогенным. При рН = 2его присутствие в фоновом электролите повлияло на заметный рост эффективности приэлектрофоретическом разделении белков: альбумин (N=110 000 ± 90), миоглобин (N= 99600 ± 230), лизоцим (N=250 000 ± 80) (рис.17), что является следствием модификацииполимером стенок кварцевого капилляра.
Это позволило предотвратить сорбцию белков,которые даже в сильно кислых средах сорбируются на стенках капилляра.Интересные результаты получены ипри введении в фоновый электролитвысокофторированных сополимеров с N,Nдиэтилкарбоксамидными и N,N-диэтиламиногруппами. При рН = 2, в отличие от аналоговс анионными терминальными группами,анодный ЭОП не генерируется (режимотрицательной полярности; ввод образца состороны катода), и, значит, модификацияРис.17.
Электрофореграммы модельной смесибелков: 1-лизоцим, 2-миоглобин, 3-альбумин.стенок капилляра не происходит. Однако этиУсловия: система КЭ «КАПЕЛЬ 105М», 214 нм, 20фторполимеры могут выступать в качествекВ, ввод пробы, 2 с, 30 мбар. Фоновый электролит:100 мМ фосфатный буферный раствор, рН 2, 4 мг/млкатионныхмицеллоподобныхФП-SO2NH2, 15% объемн.
CH3CN.псевдостационарных фаз при разделениианалитоввусловияхположительнойполярности (ввод образца со стороны анода)в кислой среде, что подтверждено нами приразделении смеси нейтральных аналитов стероидных гормонов (рис.18).При рН фонового электролита 10стенки кварцевого капилляра заряженыотрицательно. В этих условиях рольпсевдостационарнойфазывыполнилиРис. 18. Электрофореграммы смеси стероидныхгормонов,25мкг/мл(1–11дезоксикортикостерон, 2 – 11-дезоксикортизол, 3– кортикостерон, 4 – кортизон, 5 – кортизол).Условия: система КЭ «КАПЕЛЬ 105М», 254 нм, 20кВ, ввод пробы 2 с 30 мбар.
Фоновый электролит: 30мМ фосфатный буферный раствор (рН 2), 15% СН3CN:А- 4 мг/мл ФП-СONEt2; Б - 4 мг/мл ФП-NEt2.фторполимеры с анионными функциями,обеспечивселективное разделениекортикостероидовсвысокойэффективностью.Полимерс- +карбоксилатными группами ФП-СОО К(рис.20)обеспечил более высокиефакторыселективности(α),чемфторполимер c сульфонатными группамиФП-SO3-N(Et)4+(рис.19.).
Это, в сочетаниис простотой его синтеза делает ФП-СООК+ более предпочтительным.Рис. 19. Электрофореграммы смеси стероидныхгормонов, 25 мкг/мл (1 – кортизол, 2 – кортизон, 3 –кортикостерон, 4 – 11-дезоксикортизол, 5 – 11дезоксикортикостерон).Условия:системаКЭ«КАПЕЛЬ 105М», 254 нм, 20 кВ, ввод пробы 30 мбар, 2 с.Фоновый электролит: 0,4 мМ ФП-SO3-N(Et)4+, 30мМборатный буферный раствор (рН 9), 15% ацетонитрил.17Наличие фторсодержащих алифатических цепей в молекулах полимеров обеспечиваетдополнительные гидрофобные взаимодействия с молекулами аналитов, что приводит кбольшей эффективности и селективности разделения по сравнению с ДДСН (табл.8).Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
