Диссертация (1150291), страница 5
Текст из файла (страница 5)
11). На первойстадии мочевая кислота превращается в аллантоин с выделением перекисиводорода, которая восстанавливает ионы Со2+ до Со+. На второй – происходитокисление ионов Со+ до Со2+,что регистрируется в качестве аналитическогосигнала. В [75] обсуждается экспрессность такого анализа и низкая стоимостьпроизводства подобных «сэндвичевых систем».Рис.
11. Принцип, лежащий в основе работы биосенсора на мочевуюкислоту.Разработаны биосенсоры для определения оксалат-иона в моче [76-78]. В ихоснове лежит реакция окисления щавелевой кислоты оксалат-оксидазой свыделением углекислого газа и образованием пероксида водорода (рис. 12) [78].27Рис. 12. Принцип, лежащий в основе работы биосенсора на оксалат-ион.Основным достоинством биосенсоров считается высокая селективность,обусловленная специфичностью протекающих реакций.
К недостаткам относятсложность воспроизводимости микроструктуры поверхности при нанесениислоя биологически активного фермента.Среди гибридных методов анализа при определении маркеров МКБнаибольшеераспространениеполучилихроматографические[79-82]иэлектрофоретические [82-88] методы.Так, для обнаружения ионов кальция и магния в моче используют ионнуюхроматографию с пьезоэлектрическим детектором [79]. На катионообменнойколонке длиной 15см (5×150 мм) с использованием подвижной фазы с pH 4.0 идобавками винной кислоты и этилендиамина достигались времена элюированиядля ионов магния и кальция 2,2 и 2,7 мин, соответственно.
В [80] предложенапробоподготовка образцов мочи,удалениявключающая фильтрацию образцов длябелковых компонентов, с последующимопределением мочевойкислоты методом ионной хроматографии с кондуктометрическим детектором визократическом режиме.Совместное определение креатинина и мочевой кислоты рекомендуютпроводить методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим [81] или УФдетектированием [82]. Использование тандемной масс-спектрометрии, какодного из самых чувствительных методов анализа, приводит к низким пределамобнаружения (10 мг/л для креатинина и 5 мг/л для мочевой кислоты) и малымвременам элюирования аналитов (1,2 мин в случае креатинина и 1,7 мин - длямочевой кислоты).
Используют изократический и градиентный режимыэлюирования [81].28В [82] предложен метод совместного определения креатинина и мочевойкислоты методом гидрофильной ВЭЖХ (HILIC) с фосфатным буфером (рН 4,75)в качестве элюирующей системы и спектрофотометрическим детектированием(205 нм). Пробоподготовка включала осаждение белков ацетонитрилом,фильтрование надосадочной жидкости с последующим разбавлением.Метод капиллярного электрофореза, характеризующийся существеннобольшей эффективностью по сравнению с ВЭЖХ, предпочтителен дляопределения ионных и ионогенных маркеров МКБ. Первые публикации поопределению катионов и анионов в моче методом КЭ появились в конце XX в.[86]. Совместное определение катионов аммония, натрия, калия, кальция,магния, а также анионов хлорида, нитрата и сульфата обсуждается в [49, 83].ПрименяетсякосвенноеУФ-детектирование:врабочийбуфервводятпоглощающие добавки (при определении катионов - бензимидазол, а анионов хромат-ионы).Успешное определение органических анионов (урат, цитрат и оксалат)методом КЭ с УФ детектированием обсуждается в [49, 84-86].
Отмечено, чтоиспользование 0,2 М фосфатного буфера (рН 6,0) приводит к довольно высокойсиле тока (до 210 мкА), что обеспечивает совместное определение оксалат- ицитрат-ионов [49]. Применение для этих целей микрофлюидных чиповпозволило снизить объем вводимой пробы и пределы обнаружения в десятки раз[87].В [88] основные маркеры МКБ определяли методом капиллярногоизотахофореза с кондуктометрическим детектированием. Используя различныесистемы ведущих и терминальных электролитов, проведен качественный иколичественный анализ органических (урат, оксалат) и неорганических ионов(фосфат, а также ионы кальция, магния, натрия, аммония) с пределамиобнаружения ~ 10 ммоль/л.
Общее время анализа по сравнению с ионнойхроматографией и капиллярным зонным электрофорезом (КЗЭ) оказалосьсущественно меньше.29Один из важнейших маркеров МКБ - белок Тамма-Хорсфалла —определяют методом динамического светорассеяния [89], позволяющим оценитьразмер частиц этого биополимера. Если значение указанной величины достигает1 мкм, это свидетельствует о большой вероятности возникновения МКБ.Содержание белка Тамма-Хорсфалла в моче определяют эксклюзионнойхроматографией[90],атакжеметодомВЭЖХсфлуоресцентнымдетектированием [91].
Установлено, что соотношение креатинина и белкаТамма-Хорсфалла в моче свидетельствует о различных почечных патологиях.Основные тенденции при определении маркеров МКБ приведены в табл. 2.Таблица 2. Основные методы анализа, применяемые при определениимаркеров мочекаменной болезниМетодТест-методыПотенциометрияЭлектрохимическиеВольтамперометрияБиосенсоры сразличнымиспособамидетектированияПотенциометрическоеЛюминисцентноеАмперометрическоеИоннаяЭксклюзионнаяХроматографияВЭЖХКапиллярный электрофорезОпределяемыекомпонентырНКальций,Натрий,КреатининНатрий,Фосфат,Креатинин, Мочеваякислота,Оксалат[57][62],[63],[70][64],[65],[66], [70],[67-69],[76]КреатининМочевая кислота,Оксалат[70-72],[74-75],[76-78]Кальций, магний,мочевая кислотаБелок ТаммаХорсфаллаКреатинин, мочеваякислота,Белок ТаммаХорсфаллаАммоний, калий,натрий, кальций,магний, нитрат,сульфат, фосфат,мочевая кислота,креатинин, оксалат,цитрат[79],[80]Ссылки[90][81-82][91][49], [83], [87],[49],[84-88]301.2.2.
Чай как объект исследования1.2.2.1. Классификация видов чаяЧай – напиток, получаемый завариванием или настаиванием листа чайногокуста (Camellia sinensis). Все виды чая производят из одного и того же растения,отличия состоят в обработке. Существует несколько подходов к классификациисортов чая. Наиболее распространенный – классификация по степениферментации, т.е. окисления клеточного сока чайного листа под воздействиемразличных факторов. Подразделяют чай на 6 групп: черный, зеленый, желтый,белый, оолонг и пуэр (табл. 3) [92].Таблица 3. Основные виды чая [92]Название чаяОсновные отличияЗеленыйНеферментированныйОолонгФерментирован на 25-60%БелыйНеферментированный.
Особые условия выращиванияЖелтыйПроизводится из полураспустившихся почекЧерныйПолная ферментацияПуэрДвойная ферментацияЗа несколько последних десятилетий зеленый чай неоднократно являлсяобъектом медико-биологических исследований с целью определения влияния наздоровье человека [92]. Главная особенность производства зеленого чаязаключается в технологии обработки, при которой не происходит ферментациичайного листа. Именно поэтому зеленый чай характеризуется максимальнымсодержанием катехинов – антиоксидантов полифенольного типа.Чай с частичной ферментацией называют оолонг. Разная степень ферментации и другихтехнологических приемов обеспечивает разнообразие вкуса и аромата. Такой чай сочетает в себелучшие качества зеленого и черного за счет благоприятной комбинации катехинов и их полимерныхмолекул – теафлавинов и теарубигинов.В последние годы весьма популярным стал белый чай. Уникальные качества и его ароматсвязаны с условиями выращивания и переработки.
Он плохо хранится и транспортируется, т.к. из-заотсутствия ферментации очень требователен к условиям хранения. Его собирают, когда почкипокрыты тонкими белыми ворсинками, а листья еще не распустились. Оздоровительное действие31белого чая связано с повышенным содержанием в нем полифенолов (в 15-20 раз больше, чем в другихсортах чая).Желтый чай, достаточно редкий, относят к слабо ферментированным. Технология егопроизводства заметно отличается: используют нераспустившиеся почки в строго определенное время,соблюдая главные критерии: не собирать в дождь, не собирать поврежденные почки и т.д. В итоге наизготовление 1 кг желтого чая отбирают 50 тыс. чайных почек высшего качества. Особенность такогочая в большем, чем в зеленом и черном, содержании кофеина.Черный чай прошел длительную технологическую цепочку в процессе изготовления.Ферментацию прекращают, когда аромат чая становится оптимальным, что устанавливают толькоопытные специалисты.
Характерный черный цвет и особый «смолистый» аромат обусловлен высокимсодержанием теафлавинов и теарубигинов.Чай вида пуэр является постфрементированным, или сильно ферментированным, поскольку впроцессе производства помимо обычной ферментации, чайный лист подвергается стадиидополнительного старения – вторичной ферментации или "вылёживанию" чая в течение несколькихлет. Это позволяет удалить горечь и грубость свежего листа. Особенность чая пуэр: несмотря наменьшее содержание катехинов, он сопоставим по антиоксидантной активности с зеленым чаем, укоторого содержание катехинов значительно больше [92].1.2.2.2.
Химический состав чаяВ начале XX в. были проведены первые исследования химии чая наяванских плантациях, но и на сегодняшний день его точный химический составдо конца не установлен. В чае содержится около 500 различных веществ,сочетание которых уникально и не может быть заменено никакими другимирастениями, и тем более — химическими препаратами [92].Чайный лист состоит из воды и сухого вещества. В зеленых листьях чая, т.е.в исходном сырье, 73-81% воды и лишь 19-27% — сухих веществ.
В готовомчае, наоборот, на долю воды приходится 3-7%, а сухих веществ — 93-97% [92].В свою очередь, сухие вещества делятся на растворимые и не растворимыев воде. Водорастворимую фракцию сухого вещества в технологии чая называютэкстрактом. Нерастворимая фракция — это балластные вещества, остающиесяв разваренном листе в виде остатка после заваривания.
В технологии чая этучасть называют разваркой. При переработке зеленого чайного листа изменяется,главным образом, содержание экстрактивных веществ.Химические соединения, входящие в состав чая, приведены в табл. 4.32Таблица 4. Химический состав чая [92]Экстрактивные вещества41-58%Фенольные соединения (катехины,антоцианы и др.)14-26%Балластные веществаБелки42-59%20-22%Углеводы (моносахариды,дисахариды)4-5%Нерастворимые углеводы(целлюлоза, крахмал,гемицеллюлоза)Алкалоиды (кофеин, гуанин,аденин, теофиллин)2-4%Пектиновые вещества(протопектин)8-9%Гидроаскорбиновая кислота2-3%Лигнин6-7%Пектиновые вещества(гидропектин)2-3%Смолы2-3%Минеральные вещества (K, Ca,Mg, Fe, Si, Na, Al, Mn, Sr, Ni, Cu,Zn, Ba, Rb, Ti, Cr, Sn, Ag, V, I)3-4%Органические кислоты(щавелевая, яблочная, янтарная,лимонная, молочная и др.)1%Прочие растворимые вещества:водорастворимые витамины(B1, B2, B3, C, PP, K, U, P);азотистые вещества(растворимые в воде белки,аминокислоты);ферменты (окислительные игидролитические);ароматические вещества;спирты;пигменты (хлорофилл, каротин иксантофилл)10-12%Прочие нерастворимыевещества:нерастворимые (соединенныес белками) дубильныевещества;жирорастворимыевитамины (А, К, Е);нерастворимые минеральныевещества;нерастворимые ферменты(соединенные снерастворимой частью клетки)5-18%1-2%Во время технологической переработки сырья полифенольные соединениязеленого листа претерпевают окислительные превращения.
Именно с этимсвязано присутствие в черном чае, в отличие от зеленого, теафлавинов итеарубигинов (продуктов конденсации флаван-3-олов) (рис. 13), определяющихаромат и интенсивную окраску черного чая.33OHOROHOHOHHOHOOHOOOHOФерментативноеокислениеполифеноловOHOHэпикатехинHOOROHOROROHOHтеафлавиныOOHOOHOOHOHOOHCOOHOCOOHOHOOHOHOэпигаллокатехинOROHтеарубигиныРис.13. Схема образования конденсированных полифенолов в процессеполучения черного чая на стадии ферментации [92].По степени ферментации различают слабоферментированные (зеленые,белые,желтые),полуферментированные,илиулуны(красные,синие,фиолетовые), ферментированные (черные) и переферментированные (пу-эры)сорта.Дляоценкикачествачаяиспользуютследующиекритерии:антиоксидантная активность (суммарное содержание полифенолов); оценкааромата; содержание аминокислот; кофеина и др.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
