Автореферат (1150287), страница 3
Текст из файла (страница 3)
7. Структурные формулы капецитабина (слева) и 5-фторурацила (справа)Существенное различие в свойствах этих аналитов затрудняло их совместноеизвлечение из биологической жидкости. Варьировались природа (метанол, ацетонитрил,трихлоруксусная кислота) и количество реагентов для осаждения белков, условияжидкостно-жидкостной экстракции (этилацетат, гексан, метилтретбутиловый эфир) исорбционного концентрирования. Тем не менее после пробоподготовки плазмы крови сдобавкой капецитабина и 5-фторурацила при масс-спектрометрическом анализе образцовнаблюдалось сильное подавление ионизации вплоть до полного отсутствия аналитическихсигналов (MF→0).
Ни один из опробованных сорбционных материалов (Sep-Pak tC18, OasisHLB, Oasis WCX, Oasis MCX, Oasis MAX) не обеспечил полного и одновременногоудерживания капецитабина и 5-фторурацила при загрузке образца.Проблема была решена в процессе сорбционного концентрирования на сверхсшитомполистироле Purosep 200: достигнуты высокие степени извлечения – 98±2% длякапецитабина и 84±1% для 5-фторурацила, и практически полностью устранен матричныйэффект.4-ая глава посвящена еще одному обнаруженному нами эффекту проявления матрицы– нарушению линейности градуировочной зависимости, что выявлено на высокихконцентрационных уровнях при определении ропинирола — препарата, применяемого приболезни Паркинсона (рис.8).14Следует подчеркнуть, что это вызвано не перегрузкой колонки.
Данный эффектпроявлялся исключительно для образцов плазмы крови, в то время как для водныхстандартных растворов линейность градуировки не нарушалась. Причиной могли бытьконкурентные процессы за ионизацию между молекулами аналита и компонентамиматрицы.На рис. 8 сплошнойобозначеналиниявычисленнаятренда,понаименьшихy = 0,0006 x + 0,1401R2 = 0,8989методуквадратов.Пунктирная линия соединяетэкспериментальныеградуировочные точки.
Приувеличенииконцентрацииропиниролалинейностьградуировочной зависимостинарушается.РешениеэтойРис. 8. Проявление «эффекта нарушениялинейности»градуировочнойзависимостиприопределении ропинирола в плазме кровипроблемы независимо осложнялось еще и крайне низким требуемым пределом определенияаналита – 10 пг/мл.От жидкостно-жидкостной экстракции при извлечении ропинирола из плазмы кровимы отказались в пользу сорбционного концентрирования на катионообменном сорбентеOasis MCX, обеспечившим получение экстрактов с минимальным содержаниемсопутствующихкомпонентов.Эффектнарушениялинейностиградуировочнойзависимости в этом случае ужене проявлялся (рис.
9).Подобнаянарушениеy = 0,0024 x + 0,0616проблемалинейности–R2 = 0,9981–возникла и при хромато-массспектрометрическомопределениипрепаратациклосерина (рис. 10).Подготовкапробыканализу включала, как и впредыдущемслучае,Рис. 9. Градуировочная зависимость послеустранения«эффектанарушениялинейностиградуировочной зависимости» при определенииропинирола в плазме кровисорбционноеконцентрирование на катионите Oasis MCX – полимере со смешанной обращенно-фазовой15и катион-обменной функциональностью(рис.11). Поверхностные сульфогруппыy = 0,4542 x + 0,213обеспечивалиR2 = 0,9651избирательностьпоотношению к катионным аналитам. Приэтоммолекулыциклосеринастольпрочно связывались с функциональнымигруппами сорбента, что последующееэлюирование лекарственного веществаоказалосьзатруднительным.Намиприменен способ перевода сорбента ваммонийную форму.А именно: перед загрузкой образцаРис.
10. Градуировочная зависимостьпри проявлении «эффекта нарушения через сорбент пропускался аммонийнолинейности» при определении циклосерина вформиатный буфер, ионы аммония NH4+плазме кровисвязывались с функциональными группами, ослабляя взаимодействия молекулциклосерина с сорбентом. Затем вводили плазму крови с добавкой циклосерина,подкисленную муравьиной кислотой. Далее проводили элюирование 5%-ным растворомаммиака в метаноле.Установлено, что на степень извлечения циклосерина влияет концентрацияаммонийно-формиатного буфера (рис.12).
Если она незначительна – около 10мМ –молекулы циклосерина прочно удерживаются на сорбенте. Если, наоборот, она слишкомбольшая – 1М раствор – сульфогруппысорбента максимально дезактивированы, иудерживаниеаналитаОптимальнымнепроисходит.оказалсяпромежуточный вариант – концентрация100 мМ. Достигнутая степень извлечения –77%.Итоговаясхемапробоподготовкиплазмы крови для извлечения циклосеринапредставлена на схеме 1.16Рис. 11.
Фрагмент структурысорбента Oasis MCXРис. 12. Влияние концентрации формиатно-аммонийного буфера на степеньизвлечения циклосерина из плазмы крови.Схема 1. Этапы процедурыподготовки плазмы крови к анализупри определении циклосеринаНаиболееподходящимприхроматографическомциклосеринаопределенииоказалсярежимHILIC–Кондиционированиеметаноламмонийно-формиатный буфер (рН 2.5)Hydrophilic interaction liquid chromatography,т. е.
разделение с участием гидрофильныхвзаимодействийитрехкомпонентнойэлюирующейсистемойсоставаметанол:пропанол-2:ТФУ (метанол:пропанол-Загрузка пробыплазма кровивнутренний стандарт (ниацин)аммонийно-формиатный буфер (рН 2.5)муравьиная кислота2:0,15% ТФУ, (67:28:5; объемн.)).ПромывкаНесмотря на достигнутое, и здесь прихромато-масс-спектрометрическомопределениианалитамыстолкнулисьснарушением линейности, которое устраненовода0.07 мМ раствор HClЭлюирование5%-ный раствор аммиака в метанолеуменьшением объема вводимой пробы, чтопозволило избежать попадания в ионныйВыпариваниеисточник значительного количества матричных~30 мин в токе N2, 30°Скомпонентов (рис.13).Растворение и анализметанол:пропанол-2 (70:30) (об.)0.075% (об.) трифторуксусная кислота17Вглаве5-ойприменениеобсуждаетсяпредложенныхметодическихрешенийфармакокинетическихлекарственныхy = 1,0081 x - 0,072приR2 = 0,9988исследованияхпрепаратов.Всеразработанные методики валидированы всоответствиисмеждународнымитребованиями и апробированы нами вклинических исследованиях.Получены сравнительные данные,позволившиесопоставитьобщуютоксичность при внутривенном введениии при перфузии изолированного органа(легкого)диаграммераствором(рис.14)цисплатина.НапредставленыРис.13.Градуировочнаязависимость после устранения «эффектанарушения линейности» при определениициклосерина в плазме кровифармакокинетические кривые – зависимости концентрации лекарственного вещества вплазме крови от времени для пациентов, подвергнувшихся перфузии.
Пунктирной линиейобозначено максимальное содержание цисплатина при внутривенном введении. Видно, чтопроцедураизолированнойперфузиипозволяетдобитьсязначительноменьшихконцентраций в плазме крови, а значит и снизить общую токсичность препарата.
Для всехостальныхРис. 14. Фармакокинетические кривые цисплатина припроведении изолированной перфузии легкого у 10 пациентов18лекарственных препаратов проведены открытые рандомизированные перекрестныеисследования сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности при пероральномприеме взрослыми добровольцами.На рис.15, в качестве примера, представлены полученные нами фармакокинетическиекривые циклосерина после приема референтного и тестируемого лекарственного средства.Согласноустановленнымтребованиям,еслифармакокинетическиекривыедляреферентного и тестируемого препарата совпадают более, чем на 90%, они могут считатьсябиоэквивалентными, что и было показано для исследованных лекарств.В рамках апробации разработанных методик проведено 7 клинических исследованийв сотрудничестве с российскими и европейскими фармацевтическими компаниями.Проанализировано более 6000 образцов плазмы крови.Тестируемый препаратРеферентный препаратРис.
15. Фармакокинетические кривые циклосерина после перорального приема250 мг референтного и тестируемого препаратов 23 добровольцами19В таблице 4 представлены данные о линейных диапазонах разработанных методик, степени извлечения аналитов, видах матричныхэффектов, обнаруженных нами, и способы их устранения.Таблица 4. Обнаруженные матричные эффекты и способы их устраненияЛинейныйдиапазонСтепеньизвлечения, %(n=10)Силденафил1-1000 нг/мл95±4Цисплатин10-400 нг/мл92±3Капецитабин20-4000 нг/мл98±25-фторурацил20-800 нг/мл84±1Ропинирол10 – 2000 пг/мл89±5Циклосерин0,3-30 мкг/мл77±2АналитВид матричногоэффектаРешение проблемыусилениеВыбор подходящегоаналитического сигналаосколочного иона(плохая сходимость)(MRM-переход 475→58)Дериватизации собразованиемтрехлигандногокомплекса Pt(DDTC)3+подавлениеионизации(плохая сходимость)Применениесверхсшитогополистирола Purosep 200Переход от ЖЖЭ к ТФЭна катионообменномНарушение линейностисорбенте Oasis MCXградуировочнойзависимостиУменьшение объемавводимой пробы20CV, %(n=12)451241ЗАКЛЮЧЕНИЕПо итогам выполненной работы можно сделать ряд выводов:1.
Проведена градация матричных эффектов при хромато-масс-спектрометрическомопределении лекарственных веществ в плазме крови: подавление или усилениеионизации,нарушениелинейностиградуировочнойзависимости,неудовлетворительная сходимость результатов для биообразцов разных доноров,влияние на процессы фрагментации.2. Предложен способ устранения матричного эффекта при определении цисплатина собразованием трехлигандного комплекса платины и диэтилдитиокарбаматаPt(DDTC)3+.3. Обоснован выбор осколочного иона (MRM-переход m/z 475→58) для решенияпроблемыплохойповторяемостизначенийматричногофактораприМС/МС-определении силденафила.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
