Автореферат (1150287), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Для оценкиэффекта матрицы вычисляли значение матричного фактора MF как отношение площадианалита при вводе пробы в присутствии матрицы и в её отсутствии с использованием 12образцов плазмы крови различных доноров:M FS1S2, где S1 – площадь пика для пробы с добавкой аналита в матрицу после её пробоподготовки,S2 – площадь пика для стандартного раствора аналита.2[1] P.A.Andrews, W.E.Wung, S.B.Howell.
A high-performance liquid chromatographic assay withimproved selectivity for cisplatin and active platinum (II) complexes in plasma ultrafiltrate // Analytical Biochemistry.1984, V.143, P. 46-56.7По величине показателя MF судят о влиянии матрицы на итоговый результат. Еслизначения MF близки к единице, матричные эффекты отсутствуют. Если этот параметрменьше 1, имеет место подавление ионизации. Если же величина матричного факторапревышает 1, наблюдается усиление аналитического сигнала.При определении цисплатина матричное влияние выражалось высоким значениемкоэффициента вариации (CV – coefficient of variation) при сопоставлении показателей MFдля образцов плазмы крови 12 различных доноров, определяемый по формуле:CV(%) = ∙ 100,Xгде = √(x1 − x̅)2 + (x2 −x̅)2 +...+ (x −x̅)2– среднеквадратическое отклонение.Согласно международным критериям, установленным Европейским МедицинскимАгентством, значение CV не должно превышать 15%.В поисках решения описанной проблемы предпринята попытка усовершенствованияпроцедуры комплексообразования.
А именно, получен трёхлигандный комплекс платины идиэтилдитиокарбамата Pt(DDTC)3+, который образуется в ходе реакции:2PtCl2(NH3)2 + 6Na(DDTC) + 2H2O + O22Pt(DDTC)3+ OH- + 2NaOH + 4NH3 + 4NaClВ результате предварительных экспериментов найдены условия получения данногокомплекса. При усовершенствовании процедуры получения комплекса цисплатина идиэтилдитиокарбамата варьировали: концентрацию раствора реагента ДДТК (5-50%) в0,2 М растворе NaOH, соотношение объемов раствора цисплатина и реагента, температуру(20 – 50ºС) и время реакции (20 – 70 мин), природу органического растворителя (хлороформ,гексан, гептан, этилацетат) и его объем для проведения жидкостной экстракциикомплекса. При выборе соотношения объемов пробы и раствора ДДТК учитывали, чтоминимальный объём плазмы крови, необходимый для анализа, составляет 500 мкл.Наилучшим соотношением раствора цисплатина и раствора ДДТК в 0,2 М раствореNaOH, при котором площадь хроматографического пика аналита максимальна, а влияниепримесныхкомпонентовминимально,оказалоськонцентрация раствора реагента – 25% (рис.1).8соотношение1:1(объемн.),аMSD1 TIC, MS File (P2414142.D)MSD1 TIC, MS File (P2414144.D)MSD1 TIC, MS File (P2414148.D)API-ES, Pos, SIM, Frag: 100API-ES, Pos, SIM, Frag: 100API-ES, Pos, SIM, Frag: 100Рис.1.ВлияниеконцентрацииДДТКврастворенаплощадьхроматографического пикаобразующегося комплексаPt(DDTC)3+.3500030% DDTC300002500025% DDTC20000Условия: хромато-массспектрометрAgilent1100,колонка REPROSYL-PUR C18AQ, п.ф.
85% CH3CN, 15мМаммонийно-ацетатный буфер(рН 4), скорость потока 300мкл/мин, объем ввода 10 мкл,SIM: 639,21500020% DDTC100005000123456minУстановлено влияние температуры и времени проведения реакции на площадьхроматографического сигнала комплекса Pt(DDTC)3+ (рис.2). Так при проведении реакциипри комнатной температуре (25ºС) достигнутые площади пика аналита были существеннониже, чем при 45ºС.
Однако уже при 50ºС через 30 минут начинался процесс разрушениякомплекса Pt(DDTC)3+, о чем свидетельствует снижение значений площади пика аналита.В результате выбраны наиболее подходящие время и температура реакции – 45ºС и 50 мин.Подтверждениеструктурыкомплексапроведеносиспользованиемтандемногомасс-спектрометрическогоанализанаShimadzuприбореIT-TOF(рис.3). В масс-спектредетектируетсяионm/z 638,9 (Pt(DDTC)3+),Рис. 2. Зависимость площади хроматографическогосигнала комплекса Pt(DDTC)3+ от времени реакции приразличных температурах.который в тандемном режиме фрагментируется с образованием осколка с m/z 490,9,содержащего платину и две молекулы DDTC (рис.3, а). Спектр на рисунке 3 (б) даетинформацию о более глубокой фрагментации – осколочного иона m/z 490,9.
В нём сигналm/z 343,9 соответствует протонированному остатку после отрыва ещё одного лигандаDDTC, т. е. [Pt(DDTC)+H]+, а сигнал m/z 419,9 характеризует протонированный осколокпосле потери фрагмента N(C2H5)2. Предполагаемое строение трехлигандного комплексаплатины и диэтилдитиокарбамата представлено на рис.4.9В результате такого подходаматричный эффект был устранен, чтоA490,92(МС)надежно подтверждено на образцахплазмыкровидоноров.12-тиразличныхКоэффициентвариацииуменьшен с 34% для комплексаPt(DDTC)2 до 5% в случае комплексаPt(DDTC)3+ (табл. 1). Кроме того, судяпо отклонению среднего значенияматричногофактора(MF=0,67)приMFот1Б419,93(МС)343,9определениицисплатина в форме двухлигандногокомплекса наблюдалось подавлениеионизации.трехлигандногоПрирегистрациикомплексадляопределения цисплатина подобныйэффект не обнаруживался (табл.
1).Рис. 3. МС/МС-спектры ионов m/z 638,9(А) и m/z 490,9 (Б)Вероятно, это связано с меньшим влиянием коэлюирующихся матричных компонентов вионном источнике масс-спектрометра на ионизацию комплекса Pt(DDTC)3+ по сравнениюс двухлигандным комплексом.Рис. 4. Предполагаемая структура комплексаPt(DDTC)3+Таким образом предложен неописанный ранее вариант устранения матричногоэффекта при определении цисплатина в плазме крови с помощью получениятрехлигандного комплекса платины и диэтилдитиокарбамата. Подобный подход может10Таблица 1.
Сравнение матричных факторов и коэффициентов вариации для двуханалитических форм определения цисплатинаPt(DDTC)2MF (среднее)(n=12)0.67±0.23Pt(DDTC)3+0.93±0.05Аналитическая формаКоэффициент вариации, %345быть применен при проявлении матричного эффекта и при определении близких построению и свойствам цисплатину препаратов, таких как карбоплатин, оксалиплатин и др.Разработаннаяметодикавалидированавсоответствиисмеждународнымитребованиями и применена при исследовании общей токсичности при проведенииизолированной перфузии легкого раствором цисплатина на 15 добровольцах. Дозировкапрепарата составила 250 мг.Проблема плохой сходимости результатов обнаружилась и при тандемном хроматомасс-спектрометрическом определении препарата силденафила, несмотря на тщательноразработанную процедуру пробоподготовки.
Для извлечения силденафила из плазмы кровипредпочтение было отдано сорбционному концентрированию. Испытаны различныесорбционные материалы - гидрофобный Sep-Pak tC18, катионообменный Oasis MCX,гидрофильно-липофильный Oasis HLB – и элюирующие системы. Во всех случаяхдостигнуты высокие степени извлечения препарата (90-100%) (табл.2).Таблица 2. Сравнение степеней извлечения силденафила из плазмы крови сприменением различных сорбционных материаловСорбционный материалСтепень извлечения, %(n=10)Sep-Pak tC18(гидрофобныевзаимодействия)Oasis MCX(катионообменныевзаимодействия)95 ± 498 ± 6Oasis HLB(гидрофильнолипофильныйбаланс)90 ± 6Степень извлечения аналита вычисляли по формуле:SR 1 100S2, где R – степень извлечения (%), S1 – площадь пика в пробе с добавкойаналита до пробоподготовки, S1 – площадь пика в пробе с добавкой аналитапосле пробоподготовки.Однако чистота полученных экстрактов заметно отличалась (рис.5).Лучшая селективность извлечения силденафила достигнута с использованием сорбентаSep-Pak tC18 – эндогенные компоненты матрицы не обнаруживались при УФ-контроле.Несмотря на то, что возможное влияние матрицы максимально устранено уже на данномэтапе, проблема возникла и в этом случае.
Коэффициент вариации при тандемномопределении силденафила с детектированием по MRM-переходу m/z 475 → 282 оказался11большим – 46%. Предпринят поиск другого осколочного иона, образующегося при MRMпереходе m/z 475 → 58, при котором обозначенный эффект не наблюдался (рис.6).Рис. 5. Хроматограммы экстрактов плазмы крови после извлечения и очистки насорбентах Oasis HLB – гидрофильно-липофильный (1), Oasis MCX – катионообменный(2) и Sep-Pak tC18 – гидрофобный (3) (увеличен диапазон времени удерживаниясилденафила S).Условия: жидкостный хроматограф Agilent с УФ-детектором, колонка Agilent Eclipse Plus C18,подвижная фаза 40 об. % CH3CN - 60 об. % 40 мМ ацетатно-аммонийного буферного раствора (рН 7),скорость потока 300 мкл/мин, длина волны детектора 290 нм.Для оценки матричного эффекта при определении силденафила для каждого из MRMпереходов вычисляли значение матричного фактора MF по приведенной ранее формуле для12 образцов плазмы крови различных доноров, а также оценивали коэффициент вариации(табл.3).Таблица 3.
Сравнение матричных факторов и коэффициента вариации приопределении силденафила в плазме крови при использовании двух различныхMRM-переходов.MRM-переходm/z 475→282m/z 475→58Среднее значениематричного фактора MF1,34±0,620,89±0,04Коэффициент вариации CV, %464Разработанная методика включала процедуру сорбционного концентрирования насорбенте Sep-Pak tС18 со степенью извлечения силденафила 95±4%, который был выбранна основании получения экстракта с наименьшим содержанием сопутствующихкомпонентов.12Рис. 6. Масс-спектр силденафила в режиме scan 470-480 m/z (А); МС/МС-спектр силденафила (scan 50-60 m/z) (Б);МС/МС-спектр силденафила (scan 280-290 m/z) (В)I, отн.ед.[M+H]m/z 475А+m/z, Даm/z 475 → 282I, отн.ед.m/z 475 → 58Бm/z 282Фрагмент дляколичественногоопределенияm/z, Да13I, отн.ед.Фрагмент дляколичественногоопределенияm/z 58Вm/z, ДаРазработка методики одновременного определения противоопухолевого препаратакапецитабина и его основного метаболита 5-фторурацила (рис.7) представила наибольшиетрудности: матричные эффекты проявлялись как в подавлении ионизации, так и в плохойповторяемости значений матричных факторов для образцов плазмы крови различныхдоноров.Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
