Автореферат (1145979), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Все изолятыобладали геном устойчивости к фосфомицину, большинство – генамиустойчивости к фениколам, сульфаниламидам и триметоприму.Наличие столь разнообразного набора генов резистентности в целомхарактерно для нозокомиальных изолятов, циркулирующих в РоссийскойФедерации и других регионах мира. Определенный интерес представляет ответна вопрос произошел ли импорт продуцентов карбапенемаз со всем наборомгенов резистентности или часть генов приобретена в процессе циркуляции вРоссии.Полученные данные в очередной раз подчеркивают трудность леченияинфекций, вызванных продуцентами карбапенемаз в связи с наличиемассоциированной устойчивости ко всем важнейшим антибиотикам, а также намолекулярном уровне демонстрируют результат длительной циркуляциивнутрибольничных штаммов в условиях постоянного влияния антимикробнойтерапии.10Оценка частоты носительства и разнообразия продуцентовкарбапенемаз пациентами отделений реанимации в СанктПетербургеДля выявления пациентов, являющихся носителями продуцентовкарбапенемаз, был внедрён протокол включающий забор ректального мазка,обогащение культуры в среде с карбапенемным антибиотиком, определениегенов карбапенемаз с помощью ПЦР «в реальном времени» (blaKPC; blaOXA-48;blaNDM-; blaVIM-; blaIMP-; blaOXA-40-; blaOXA-23-; blaOXA-51-; blaOXA-58-типов), высевобогащенной культуры на среду с меропенемом, идентификацию культур иповторную детекцию генов карбапенемаз.Всего было собрано 140 образцов из пяти стационаров.
Геныкарбапенемаз обнаружены в 48 образцах из четырёх стационаров. В 24образцах обнаружены гены OXA-40-типа, характерные для Acinetobacterbaumanii, в 16 образцах обнаружены гены blaNDM-типа, в 5 образцах геныblaKPC-типа и в 2 образцах гены blaOXA-48–типа. Также обнаружены образцы вкоторых выявлены две карбапенемазы – OXA-48-тип (K. pneumoniae) и OXA-40– тип (A. baumannii); KPC-тип (K. pneumoniae) и VIM–тип (Pseudomonasaeruginosa).Видовойсоставбактерий-продуцентовкарбапенемаз,обнаруженных в данном исследовании ограничен тремя видами: A. baumanii,Pseudomonas aeruginosa и K. pneumoniae, из которых только K. pneumoniaeотносится к семейству Enterobacteriaceae.
В первом стационаре обнаруженодин изолят K. pneumoniae продуцирующий карбапенемазу OXA-48-типа. Вовтором стационаре 16 изолятов продуцировали карбапенемазу NDM-типа иодин изолят – OXA-48-типа. В третьем стационаре продуценты карбапенемазсемейства Enterobacteriaceae не были обнаружены, в четвёртом стационаребыло обнаружено пять продуцентов карбапенемазы KPC-типа. Следуетотметить, что состав продуцентов карбапенемаз варьирует в каждомстационаре.
Данную локальную специфику необходимо учитывать припроведении скрининга (для оптимизации методов выявления продуцентовкарбапенемаз), а также для оценки эффективности принимаемых действий посдерживанию их распространения. Базовый анализ, включающий видовуюидентификацию изолята, определение типа гена карбапенемазы и проведениетипирования ядерного генома по схеме MLST позволяет в практике отличитьвнутрибольничный штамм от нового случая импорта.Таблица 3.Данные анализа приобретённых детерминант резистентности изолятов-продуцентов карбапенемаз№изолята/сиквенстипКарбапенемаза57/ST 340blaNDM-1410/ ST 340blaNDM-1552 /ST 340blaNDM-1783/ST 101blaNDM-1565/ST273blaKPC-2570/ST258485/ST395Группы антибиотиковАминогликозидыΒ-лактамыФторхинолоныФосфом МакролицинидыФениколыСульфонамидыТриметопримaph(3')-VIaaadA2aac(6')Ib-craph(3')-VIaaadA2aac(6')Ib-crarmAaac(3)-IIaaac(6')Ib-craadA2aac(3)-IIablaSHV-11oqxBoqxAaac(6')Ib-craac(6')Ib-crqnrB1fosAmsr(E)mph(E)catB3sul1dfrA12fosAmsr(E)mph(E)catB3sul1dfrA12blaCTX-M-15blaSHV-11oqxAoqxBaac(6')Ib-crfosAmsr(E)mph(E)catB3sul1dfrA12blaCTX-M-15blaSHV-1oqxBfosAmsr(E)mph(E)sul1dfrA12blaTEM-1blaSHV-11blaCTX-M-15mph(A)catB3sul2dfrA14tet(A)blaOXA-48aac(6')Ib-crblaSHV-11blaCTX-M-15blaTEM-1blaOXA-1oqxAqnrS1oqxBaac(6')Ib-croqxBoqxAaac(6')Ib-croqxAoqxBaac(6')Ib-crqnrS1fosAblaKPC-2aph(3')-VIaaadA2armAstrAaac(3)-IIaaac(6')Ib-crstrBaac(6')-IbcatB3catA1sul1dfrA1tet(A)blaCTX-M-15blaOXA-1blaTEM-1blaSHV-11ТетрациклинфfosAfosAСтруктура генетического окружения гена blaKPC-2 у изолята Klebsiellapneumoniae №565Перенос плазмиды, несущей ген blaKPC-2, был осуществлён с помощьютрансконъюгации KP 565 в качестве донора и E.
coli C-600 AzR RifR в качествереципиента. Карта мобильного элемента построена на основе сравнения поалгориму BLAST с генами, представленными в базе данных GenBank (Рисунок2)Рис. 2. Карта гипотетического мобильного элемента, несущего ген blaKPC-2.Красным выделены области гомологичные варианту генетическогоокружения описанные на плазмиде pKP048 (NCBI Reference Sequence:NC_014312.1).Гипотетический мобильный элемент фланкирован инвертированнымиповторами Tn3-типа, включает в себя (слева направо) фрагмент генатранспозазы, в которой встроился мобильный элемент несущий геныустойчивости к макролидам (mphA, mrx, mphR), IS- элемент Kpn8, фрагментгена blaTEM, несущий однонуклеотидные замены, не характерные дляописанных ранее полных вариантов данного гена. Далее следует фрагмент,включающий ген blaKPC-2 и транспозазы, представляющие область,гомологичную каноническому варианту генетического окружения, т.е.транспозону Tn4401 и его изоформам.
Далее следует фрагмент, несущий гены,кодирующие ферменты антирестрикции (KlcA), фрагмент транспозона Tn1721,после чего следует фрагмент транспозона Tn3 с геном blaTEM-1. Данный вариантгенетического окружения имеет высокую степень гомологии отдельныхучастков с вариантом NTEkpc-1a (Chen, L., et al., 2014), представленным наплазмиде pKP048 (Рис 2.). Сравнение с данным вариантом генетическогоокружения выявило инсерцию мобильного элемента с генами устойчивости к13макролидам (см. выше), инсерцию фрагмента гена blaTEM, а также заменуфрагмента транспозона Tn1721 на фрагмент транспозона Tn3.Эпидемиология и возможная эволюциявключающих TEM-KPC-комплексмобильныхэлементовАнализ фрагментов, представленных в базе GenBank, показал 100%гомологию последовательности, присутствующей на плазмиде pKPAPSS сфрагментом длиной 3893 п.о., описанную у изолята, выделенного в Сингапуре(GenBank: KC344543.1).
Изолят, у которого был выделен данный вариантгенетического окружения, относится к ST841, проведенный авторами анализ(Koh, T.H., et al., 2012) типов несовместимости плазмид не выявил IncFIIгруппу. Так как ST841 не относится к клональному комплексу 147 (СС147),можно сделать предположение, что распространение данного элемента, еслиисходить из гипотезы о близкой филогении, основанной на отсутствии SNP,происходитчерезперемещениетранспозонамеждуплазмидамиEnterobacteriacea. Также в пользу этой гипотезы говорит видовое разнообразиебактерий, у которых были выявлены подобные комплексы (табл. 4).Отсутствие в GenBank полногеномных последовательностей дляприведнных в таблице трех случаев выявления ТЕМ-КРС – комплекса непозволяет проводить прямое сравнение последовательностей.
Так какхарактерным для всех записей является наличие гена blaTEM–типа выше генаblaKPC-2, то единичные полиморфизмы использовались для анализаэпидемиологии данного комплекса. Сравнение генов TEM–типа приведено втаблице 4.Анализ фрагмента гена blaTEM показал три варианта.
1. Делеция 291 п.о.по сравнению с референсной последовательностью blaTEM-1 и двеоднонуклеотидные замены 396 (T-G) 643 (G-A), 2. делеция 342 п.о. саналогичными заменами. 3. вариант с делецией 342 п.о., но с дополнительнойтретьей заменой в позиции 549 (G-A). Исходя из этих данных, мы можемвыдвинуть две гипотезы:1. В результате генетических событий TEM-KPC комплекс появилсянезависимо, в результате транспозиций поTn3-повторам(классический Tn-3 транспозон включает ген blaTEM-1), которыехарактерны для Tn4401.2.
Мы наблюдаем микроэволюцию минорного варианта мобильногоэлемента, сформировавшегося однократно.14Таблица 4.Описанные варианты генетического окружения, включающие TEM-KPCкомплексВидAeromonas hydrophilaKlebsiella pneumoniaeEscherichia coliCitrobacter freundiiKlebsiella oxytocaKlebsiella pneumoniae N=5Klebsiella pneumoniae (TEM-1)Escherichia coli (KPC-3)Klebsiella pneumoniae 565ДатавыделенияСтранавыделенияST/Inc-группаНомерGeneBank2012201220082008КитайСингапурАргентинаАргентинаKC355363.1KC344543.1JN048641JN048639.120092006-20072008До 20102012КитайКитайИзраильКитайРоссияNDST841/non IncFII16 изолятов сразличнымиплазмидамиNDNDST15/IncNNDST273/IncFII-IncRNG_041239.1NDKJ510411.1NG_036720.1KP008371.1Таблица 5.Характеристика известных фрагментов гена blaTEM в TEM-KPC комплексе посравнению с референсной последовательностью гена blaTEM-1.Вариант окруженияРазмер делецииПозиция замены(относительно TEM-1)blaTEM-1K.pneumoniae Израиль339 (T-A) 344 (T-A)E.coli Аргентина291 bp396 (T-G) 643 (G-A)C.
freundii Аргентина291 bp396 (T-G) 643 (G-A)A.hydrophila Китай291 bp396 (T-G) 643 (G-A)K.pneumoniae Сингапур342 bp396 (T-G) 643 (G-A)K. oxytoca Китай342 bp396 (T-G) 643 (G-A)pkpcAPSS342 bp396 (T-G) 643 (G-A)E.coli Китай blaKPC-3342 bp396 (T-G) 549 (G-A) 643 (G-A)В пользу второй гипотезы говорят общие для всех секвенированныхвариантов фрагмента гена TEM специфичные SNP. В этом случае появлениеданного варианта генетического окружения, на сегодняшний день, можносвязать с территорией Израиля, где в TEM-KPC комплексе представленапоследовательность гена TEM без делеции (табл.
3). А наиболее эволюционноотдалённым вариантом можно назвать вариант, выделенный в Китае ивключающий ген blaKPC-3. Присутствие в комплексе TEM-KPC-3 SNP,аналогичных комплексу TEM-KPC-2, говорит либо о наличии у фрагмента генаTEM неизвестной функции, которая определяет консервативность замен внезависимо сформировавшихся TEM-KPC комплексах, либо об общихзакономерностях, которые приводят к независимому формированию такойконструкции. Во всех перечисленных вариантах гена blaTEM (таблица 5),15фрагмент начинается со стартового кодона (ATG), что допускает процесстрансляции и может означать наличие у данного гена функции.Практические рекомендацииПри анализе результатов оценки антибиотикочувствительностиграмотрицательных бактерий – возбудителей госпитальных и внебольничныхинфекций необходимо выявлять изоляты, подозрительные на продукциюкарбапенемаз.К подозрительным следует относить изоляты в отношении которых МПК(или диаметр зоны задержки роста, при использовании диско-диффузионногометода), хотя бы одного карбапенемного антибиотика превосходит значение«эпидемиологической точки отсечения», рекомендуемых EUCAST.Для верификации продукции подозрительными изолятами карбапенемази наличия у них соответствующих генов следует использовать фенотипическиеметоды (тест Ходжа, масс-спектрометрию) и молекулярные тесты(традиционную ПЦР или ПЦР в реальном времени).Для оценки эпидемиологической ситуации и обоснования мероприятийпо сдерживанию распространения антибиотикорезистентности в медицинскихучреждениях среди пациентов следует проводить скрининг на бессимптомноеносительство продуцентов карбапенемаз.Перспективы дальнейшей разработки темыПолученные в исследовании данные не дают полного представления ораспространении продуцентов карбапенемаз в стационарах России.Необходимо провести исследование с большой выборкой и соблюдениемправил статистического анализа на носительство продуцентов карбапенемазсреди пациентов отделений интенсивной терапии, хирургии, ожоговыхотделений и др., где наиболее часто применение широкого спектраантибиотиков, и где распространение продуцентов карбапенемаз наиболеехарактерно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
