Автореферат (1145979), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Отдельные этапы работыбыли проведены в сотрудничестве с сотрудниками ФГБУ «НИИ ФХМ ФМБАРоссии» (г. Москва) и Санкт-Петербургским филиалом ФГБУН «Институтобщей генетики им. Н.И. Вавилова» РАН.Объем и структура диссертационной работыДиссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоитиз общей характеристики работы, 4 глав, заключения, выводов, спискасокращений и списка литературы.
Библиографический список литературывключает 178 источников литературы, в том числе 3 отечественных и 175иностранных. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 12 рисунками.Основное содержание работыМатериалы и методы исследованияВ работу включены 1115 изолятов семейства Enterobacteriaceae,выделенных от больных с разными формами внутрибольничных инфекций.Изоляты были получены в период с 2011 по 2015 год из стационаров СанктПетербурга. Идентификацию культур, выращенных на агаре МюллераХинтона, проводили с помощью MALDI-TOF масс-спектрометра Microflex LT(«Bruker Daltonics», Германия), со средним коэффициентом идентификации(score) 2,2±0,7.ДлядетекциигеновкарбапенемазиспользовалиПЦРсэлектрофоретической детекцией продуктов амплификации.
Выделениетотальной бактериальной ДНК проводили с помощью наборов «ДНК-сорб Б»(«АмплиСенс», Россия) согласно протоколу производителя. Подбор праймеров,а также расчет мультиплексных сетов, множественные выравнивания, и оценкуспецифичности осуществляли соответственно в Oligo v.7.0, ClustalW, и NCBIBLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).Мультилокусное сиквенс-типирование (MLST) осуществляли пообщепринятой схеме.Полногеномное секвенировние изолятов 57, 410, 552, 783, (blaNDM-1); 565,570 (blaKPC-2) a также 485 (blaOXA-48), было проведено c помощью генетическогоанализатора MiSeq (Illumina).
Подготовка библиотеки проводилась с помощьюкита Nextera XT DNA Library Preparation Kit согласно рекомендациямпроизводителя.ПолногеномноесеквенированиеплазмиднойДНК7трансконъюганта (несущего плазмиду с геном blaKPC-2) было выполнено спомощью прибора Ion Torrent PGM. Подготовка библиотек была проведена спомощью следующих китов: Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit, Ion PGMTemplate OT2 400 Kit, Ion PGM Sequencing 400 Kit, Ion 318 v2 Chip Kit согласноинструкциям производителя.
Сборка de novo была выполнена с помощьюпрограммы Newbler De Novo Assembler v3.0.Эксперименты по трансконъюгации проводились по следующемупротоколу: инокулюм штамма - реципиента E. coli C600 AzRRifR выращивали вжидкой среде LB при 370С в течение 12 часов при интенсивномперемешивании, аналогично выращивается инокулюм донора. Инокулюмразводили 1:50 в среде LB, после чего выращивали при 370С до ОП=0,6 (придлине волны 610 нм).
Затем суспензию клеток донора инкубировали 30 минутпри комнатной температуре без перемешивания, суспензию клеток реципиентаинкубировали 15 минут при 42 0С без перемешивания. Суспензии клетоксмешивали в соотношении 1:10 с избытком реципиента, после чего суспензиюосаждали на нитроцеллюлозном фильтре. Фильтр помещали на чашки Петри сосредой LB и инкубировали при 370С 18 часов.
Выросшие клетки смывали сфильтра средой LB, после чего высевали суспензию клеток на селективнуюсреду с азидом натрия и меропенемом для отбора трансконъюгантов.Результаты исследования и их обсуждениеОптимизация методик детекции карбапенемазной активностиизолятов, а также генов, кодирующих карбапенемазыДля детекции карбапенемазной активности с помощью MALDI-TOFмасс-спектрометрии на основе литературных данных и при внесениисущественных дополнений был разработан и апробирован и внедрён в практикусобственный протокол исследования. Протокол апробирован на коллекциифенотипически типированных (МПК определились методом микроразведений)нозокомиальных изолятов Enterobacteriacea (n=475).
Критерием отбораизолятов являлось превышение значений МПК эпидемиологической точкиотсечения по критерию EUCAST. Были отобраны 98 изолятов, из которых 22были положительны при анализе карбапенемазной активности сиспользованием собственного протокола. Методом ПЦР у 18 изолятов былиобнаружены гены ферментов NDM-типа, VIM-типа и OXA-48-типа. Четыреизолята после повторной идентификации были отнесены к неферментирующимбактериям: Stenotrophomonas maltophilia (n=2), Acinetobacter baumannii иAchromobacter xylosoxia, для которых характерны собственные хромосомнолокализованные карбапенемазы.Оптимизация методов молекулярной детекции генов карбапенемазДля молекулярной детекции генов карбапенемаз с помощьюполимеразной цепной реакции с форезным методом детекции была разработанамультиплексная ПЦР на гены blaKPC-типа, blaOXA-48-типа, а также blaNDM-типа,обеспечивающаявыявлениевариантовкарбапенемазнаиболеераспространенных в Санкт-Петербурге у представителей семейства8Enterobacteriaceae.
Подобранные праймеры, а также длина продуктовамплификации, представлены в таблице 1.Таблица 1.Праймеры для мультиплексной амплификации генов blaKPC-, blaOXA-48- иblaNDM – типовМишеньНазваниеПоследовательность праймера 5’- Продукт (по)праймера3’blaKPCMKPCFGCTGACCAACCTCGTCGCGGAA 753MKPCRGCCTCGCTGTGCTTGTCATCCblaOXA-48MOXAFTAATCTTAAACGGGCGAACCA 514MOXARAAGTTCAACCCAACCGACCCAblaNDMMNDMFTGCTCAGTGTCGGCATCACC176MNDMRGAACCAGCAACCGCGCCCAВ результате тестирования данной мультиплексной реакции на изолятах сизвестной нуклеотидной последовательностью генов карбапенемаз (blaKPC-2,blaOXA-48 и blaNDM-1) были получены чёткие фрагменты, соответствующиерасчётным размерам.
Фотография геля представлена на рисунке 1.Рисунок 1. Фотография гель-электрофореза амплификации мультиплекснойПЦР с праймерами, представленными в таблице 1. NDM –амплификация ДНК, выделенной из штамма-продуцента гена blaNDM-1;OXA-амплификация ДНК, выделенной из штамма-продуцента генаblaOXA-48; KPC-амплификация ДНК, выделенной из штаммапродуцента blaKPC-2, X – амплификация смеси равных объемов ДНК,использованных в пробах NDM, OXA и KPC.
NEG – отрицательныйконтроль.Анализмолекулярнойэпидемиологииштаммов-продуцентовкарбапенемаз NDM – и KPC – типов, циркулирующих на территорииСанкт-ПетербургаИз 53 изолятов, продуцирующих карбапенемазу NDM-1, были отобраны20 изолятов Klebsiella pneumoniae (Kpn) для проведения мультилокусногосиквенс-типирования. Анализ клональной принадлежности выявил ST340 какдоминирующий (n=17), также были выявлены ST 147 (n=2) и ST 101 (n=1).Изоляты Kpn, относящихся к ST340, были выявлены в трех стационарах Санкт-9Петербурга. Можно предположить импорт данной генетической линии изодного стационара в другие.Из 23 изолятов, продуцирующих карбапенемазы КРС–типов, былиотобраны 9 изолятов для типирования ядерного генома по схеме MLST, а такжесеквенирования гена карбапенемазы.
Были выявлены 4 варианта комбинациитипа гена и принадлежности к клональной группе: blaKPC-2 – ST273 (n=1); blaKPC2 – ST 258 (n=5); blaKPC-3 – ST258 (n=2); blaKPC-2 – ST11 (n=1). На основании этихданных можно предположить, что распространение карбапенемаз KPC-типасвязано с несколькими случаями импорта.Анализ резистома типовых продуцентов карбапенемаз на основеданных полногеномного секвенированияАнализ резистома семи случайно отобранных продуцентов карбапенемазс помощью сервиса ResFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/) выявил всреднем 12 детерминант резистентности у каждого изолята (таблица 2). Данныйсервис позволяет выявлять только приобретенные гены резистентности,мутации в собственных генах не учитываются.Прежде всего, следует отметить высокую частоту выявления у изученныхизолятов дополнительных бета-лактамаз.
У одного изолята была выявлена однадополнительная бета-лактамаза, у четырех изолятов – по две, по одномуизоляту обладали тремя и четырьмя дополнительными ферментами. У 5-ти из7-ми изолятов были обнаружены глобально распространенные БЛРС blaСТХ-М-15,с такой же частотой выявляли гены БЛРС blaSHV-11. У трех изолятов быливыявлены бета-лактамазы широкого спектра blaТЕМ-1 и у двух blaОХА-1.У всех изолятов были также выявлены гены устойчивости каминогликозидным антибиотикам, преобладали обычно локализованные наплазмидах гены аминогликозидмодифицирующих ферментов, но у двухизолятов были обнаружены гены метилаз 16S рРНК (armA). Широкораспространенными оказались и локализованные на плазмидах геныустойчивости к хинолонам (гены эффлюксных насосов – oqxА, oqxB, защитымишени - qnrB1 qnrS1 и бифункциональных ферментов - aac(6')Ib-cr).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
