Автореферат (1145939), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Анализ экспрессии генов MtIPT и MtLOG, вовлеченных в метаболизм цитокинина, приклубенькообразованииДля проверки предположения о том, что ТФ KNOX3 может активировать экспрессиюгенов MtIPT и MtLOG, вовлечённых в биосинтез цитокинина, прежде всего, необходимо былопроанализировать экспрессию генов MtIPT и MtLOG при формировании клубеньков.В геноме Medicago truncatula (Mt4.0v1) нами были найдены 21 последовательности,аннотированные как гены, кодирующие изопентенилтранферазы (IPT). Было построенофилогенетическое дерево с использованием нуклеотидных последовательностей генов IPT M.truncatula, Arabidopsis thaliana и Lotus japonicus, на основании которого было выявлено 6 геновMtIPT, являющихся близкими гомологами генов IPT арабидопсиса и лядвенца.
Эти гены былиназваны в соответствии с их предполагаемыми ортологами у лядвенца и арабидопсиса. Такжебыла выявлена уникальная группа генов MtIPT, близких гомологов которой не былообнаружено у арабидопсиса и лядвенца, последовательности которых очень схожи междусобой.Мы проанализировали экспрессию всех идентифицированных генов IPT у люцерны наразных сроках после инокуляции и выявили активацию экспрессии MtIPT1, MtIPT2, MtIPT3,MtIPT5, MtIPT9 в ответ на инокуляцию ризобиями. Экспрессия других проанализированныхгенов, в том числе экспрессия генов из уникальной группы, не изменялась в ходе развитияклубеньков.Подобным образом были проанализированы гены MtLOG, кодирующие ферменты,ответственные за образование активных форм цитокининов. Было показано, что при развитииклубеньков происходит активация экспрессии генов MtLOG1, MtLOG2 и MtLOG3.3.
Изучение роли гена MtKNOX3 у растений с измененным уровнем экспрессии этого генав трансгенных корнях.Для изучения роли гена MtKNOX3 в развитии клубеньков, а также для выявленияпредполагаемых мишеней действия ТФ MtKNOX3 нами были получены трансгенные корни8со сверхэкспрессией MtKNOX3 и c подавлением экспрессии гена MtKNOX3 с помощьюинтерференции РНК.3.1. Изучение влияния сверхэкспрессии гена MtKNOX3 на развитие клубеньков.У растений со сверхэкспрессией MtKNOX3 в корнях было обнаружено образованиеклубенькоподобных структур в отсутствие инокуляции ризобиями.
Анализ срезов такихструктур показал, что они представляют собой структуры округлой формы, в которых видноувеличение слоев клеток коры, что не характерно для примордиев боковых корней. В отличиеот нормальных клубеньков, индуцированных ризобиями, в таких структурах не формируетсяпериферическая проводящая система, а вместо этого наблюдается один центральныйпроводящий пучок, как это характерно для примордиев боковых корней (Рисунок 3).Рисунок 3 - Клубенькоподобные структуры на трансгенных корнях со сверхэкспрессиейА, Б, B – общий вид клубенькоподобных структур (показаны стрелками) на корнях сосверхэкспрессией MtKNOX3.
Флуоресценция GFP (Aи Б) подтверждает трансгенную природукорней. Г, Д поперечный (Г) и продольный (Д) срезы спонтанных клубеньков с однимпроводящим пучком. Для сравнения приведены поперечный срез нормального клубенька,индуцированного ризобиями, с периферическими проводящими пучками (Е) и поперечныйсрез примордия бокового корня (Ё). Масштабная шкала - 100 мкм. Толщина срезов, 50 мкм.Для того, чтобы подтвердить клубенькоподобную природу наблюдаемых структур, мыпроанализировали экспрессию гена MtNIN, который как было показано ранее экспрессируетсятолько в клубеньках и имеет значительно более низкий уровень экспрессии в примордиибоковых корней. Экспрессия гена MtNIN была значительно выше в клубенькоподобныхструктурах, по сравнению с примордиями боковых корней (Рисунок 4А).
Полученныерезультаты указывают на то, что наблюдаемые структуры отличаются от примордиев боковыхкорней и имеют клубенькоподобную природу. Спонтанные клубеньки наблюдали ранее убобовых растений с конститутивной активностью гена рецептора цитокинина. Чтобыпроверить предположение о том, что клубенькоподобные структуры могут развиваться врезультате накопления цитокинина на корнях со сверхэкспрессией MtKNOX3, в этихструктурах был проанализирован уровень экспрессии гена цитокининового ответа MtRR4.Экспрессия MtRR4 была значительно выше в клубенькоподобных структурах, по сравнению склубеньками, индуцированными ризобиями. (образующихся на контрольных корнях сосверхэкспрессией GUS) (Рисунок 4Б).
Таким образом, образование спонтанных клубеньков накорнях со сверхэкспрессией MtKNOX3 может свидетельствовать об участии ТФ KNOX3 вактивации цитокининового ответа при развитии клубеньков.9Рисунок 4 – Уровни экспрессии клубенек-специфичного гена MtNIN в спонтанных клубеньках, в клубеньках, индуцированных ризобиями (RIN: rhizobium-induced nodules) и в примордияхбоковых корней (LR: lateral roots) (А). Уровень экспрессии MtRR4 в спонтанных клубенькахSN) и в клубеньках, индуцированных ризобиями (RIN) (Б).На следующем этапе мы проанализировали экспрессию индуцируемых при симбиозегенов MtIPT и MtLOG в спонтанных клубеньках, формирующихся на корнях сосверхэкспрессией MtKNOX3.
Было показано увеличение экспрессии генов MtLOG2 и MtIPT3в спонтанных клубеньках по сравнению с контролем (клубеньки, индуцированные ризобиями,формирующиеся на корнях со сверхэкспрессией гена GUS). При этом увеличение экспрессиидругих проанализированных генов не было выявлено. Увеличение экспрессии MtLOG2 иMtIPT3 в спонтанных клубеньках подтверждает предположение о том, что образованиеклубенькоподобных структур на корнях со сверхэкспрессией MtKNOX3 действительно можетбыть связано с увеличением уровня активных форм цитокинина в таких трансгенных корнях.3.2. Изучение влияния подавления экспрессии гена MtKNOX3 с помощью интерференцииРНК на развитие клубеньков и экспрессию предполагаемых генов-мишеней (MtIPT,MtLOG)Для изучения роли гена MtKNOX3 при развитии симбиотических клубеньков былиполучены трансгенные корни с подавлением экспрессии этого гена с помощью интерференцииРНК (RNAi).
Мы оценили влияние подавления экспрессии гена MtKNOX3 наклубенькообразование и экспрессию генов, вовлеченных в метаболизм цитокинина. Показано,что подавление экспрессии MtKNOX3 значительно не влияет на количество и плотностьобразующихся клубеньков. Однако, в трансгенных клубеньках с MtKNOX3 RNAi наблюдаетсястатистически значимое уменьшение экспрессии генов MtIPT3, MtIPT5, MtLOG2 и MtRR4(Рисунок 5).Уменьшение экспрессии генов MtIPT3/5, MtLOG2 и MtRR4 на фоне РНК-интерференцииMtKNOX3, а также увеличение экспрессии этих генов в клубенькоподобных структурах(спонтанные клубеньки) со сверхэкспрессией MtKNOX3 подтверждает нашу гипотезу овозможном участии MtKNOX3 в активации экспрессии генов метаболизма цитокинина в ходеразвития симбиотических клубеньков.10Рисунок 5 - Снижение уровней экспрессии генов MtIPT3, MtIPT5, MtLOG2 и MtRR4 на фонеподавления экспрессии MtKNOX3 путём интерференции- РНК в клубеньках на трансгенныхкорнях (*, **, *** соответствует P-value <0.05, <0.01 и <0.001, соответственно).4.
Изучение непосредственного связывания ТФ MtKNOX3 с промоторамипредполагаемых генов-мишеней (MtIPT, MtLOG)На следующем этапе мы изучили непосредственное связывание ТФ MtKNOX3 срегуляторными последовательностями предполагаемых генов-мишеней (MtIPT, MtLOG).Известно, что транскрипционные факторы семейства KNOX связываются споследовательностями-мишенями через цис-регуляторный элемент, содержащий два мотиваTGAC. Мы провели поиск этого мотива в промоторах и интронах предполагаемых геновмишеней и нашли последовательности-кандидаты, содержащие расположенные рядом двамотива TGAC в регуляторных последовательностях генов IPT3/5 и LOG1/2.Для продукции и очистки гомеодомена (HD) ТФ MtKNXOX3, используемого вэкспериментахпоизучениюсвязыванияТФMtKNOX3срегуляторнымипоследовательностями генов-мишеней использовали метилотрофные дрожжи P.
pastoris. ДляпроверкивзаимодействиягомеодоменаMtKNOX3спредполагаемымипоследовательностями-мишенями использовали два метода: EMSA и SPR (см. «Материалы иметоды»).С помощью метода EMSA было показано взаимодействие гомеодомена MtKNOX3 срегуляторными последовательностями в генах LOG1/2 и IPT3/5 (Рисунок 6).Рисунок 6 – Результаты EMSA с использованием гомеодомена MtKNOX3 и регуляторныхпоследовательностей из генов MtLOG1 (А), MtLOG2 (Б), MtIPT3 (В) и MtIPT5 (Г), содержащийдва или более мотива TGAC.
1. Биотинилированная ДНК, 2-6. Биотинилирлванная ДНКвместе с разными концентрациями белка (MtKNOX3-HD):8, 4, 2, 1 или 0.5 мкг,соответственно), 7. Биотинилированная ДНК вместе с 2 мкг белка и 2000x немеченая ДНК(конкурент).11Кроме того, взаимодействие гомеодомена MtKNOX3 с теми же регуляторнымипоследовательностями было подтверждено с помощью метода, основанного на явленииповерхностного плазмонного резонанса (англ. SPR) с использованием системы ProteON(Рисунок 7).
В Таблице 1 приведены константы ассоциации и диссоциации для каждойпоследовательности, а также для отрицательного контроля - последовательности polyAT.Высокое значение константы ассоциации и низкое значение константы диссоциацииуказывают на высокое сродство гомеодомена MtKNOX3 к этим последовательностям, чтосогласуется с результатами, полученными с помощью метода EMSA.Рисунок 7 - Сенсограммы, показывающие взаимодействие гомеодомена MtKNOX3 срегуляторными последовательностями генов MtLOG1 (А), MtLOG2 (Б), MtIPT3 (В) и MtIPT5(Г), содержащими два или более мотива TGAC. RU: Response Unit (единица резонанса).Таблица 1 – Данные по кинетике взаимодействия между HD MtKNOX3 и регуляторнымипоследовательностями в генахMtLOG1, MtLOG2-1, MtIPT3-1 и MtIPT5.
Ka: константаассоциации, Kd: константа диссоциации, KD: константа равновесия, RU: Response Unit(единица резонанса).Результаты анализа взаимодействий с использованием двух методов, EMSA и SPR, атакже результаты РНК-интерференции MtKNOX3 указывают на то, что гены MtLOG1/2 иMtIPT3/5 могут быть прямыми мишенями транскрипционного фактора MtKNOX3.
Такимобразом, MtKNOX3 может активировать продукцию цитокинина при развитииазотфиксирующих клубеньков за счет активации экспрессии генов биосинтеза цитокинина,подобно тому, как это описано для ТФ STM и KNAT1 в апикальной меристеме побега.125. Исследование взаимосвязи ТФ MtKNOX с компонентами системы авторегуляцииклубенькообразования (AON): CLV1-подобной киназой MtSUNN и CLE-пептидами5.1.ИзучениеэкспрессиигеновсемействMtKNOXиMtIPTусуперклубенькообразующего мутанта sunn-3Авторегуляция клубенькообразования (AON) представляет собой механизм,регулирующий число образующихся клубеньков на уровне целого растения. AON включаетобмен сигналами между корнем и побегом, при этом поступающие из тканей корня CLEпептиды связываются с CLV1-подобными рецепторами, работающими в побеге. В результатеэтого происходит активация ответного сигнала, который поступает из побега в корень иподавляет образование клубеньков.
Известно, что синтезируемый в побеге цитокининпоступает в корень, где он подавляет образование клубеньков. Также было показано, что улядвенца L. Japonicus синтез цитокинина в побеге в ответ на инокуляцию происходит за счётактивации экспрессии LjIPT3, и эта активация зависит от CLV1-подобной киназы LjHAR1.Поскольку нами было показано, что ортолог этого гена у люцерны, ген MtIPT3, являетсяпредполагаемой мишенью транскрипционного фактора MtKNOX3, было изучено влияниетранскрипционных факторов KNOX на экспрессию MtIPT3 и других предполагаемыхмишеней в побеге, и изучена возможная роль MtKNOX3 в системе авторегуляции.Мы проанализировали экспрессию разных генов MtIPT в листьях на разные дни послеинокуляции ризобиями (Рисунок 8).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
