Автореферат (1145939), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Вагенингена, Нидерланды), а также мутантную линию M. truncatula sunn-3,любезно предоставленную коллегами из Университета г. Гента (VIB, UGent, Бельгия).Условия выращивания растений. Стерилизацию семян проводили с использованиемконцентрированной серной кислоты (95-97%) в течение 10 минут, после чего семенапромывали стерильной водой 7-10 раз. Семена высевали на 1% водный агар и оставляли вхолодильнике на +4 на 24 часа, затем проращивали в темноте в течение 48 часов.Выращивание растений осуществляли в фитотроне (KBW F240, Binder, Германия) с режимомдень/ночь 16/8 часов, 21oC при освещенности 30 тыс.
люкс. Образцы корней и листьев длявыделения РНК собирали на разные дни после инокуляции (дпи) ризобиями (Sinorhizobiummeliloti 2011) (с 1 дпи до 21 дпи в зависимости от эксперимента), по 3-4 растения на пробу.Штаммы микроорганизмов. Для инокуляции растений люцерны использовали штаммSinorhizobium meliloti 2011, полученный из лаборатории генетики растений Университета г.Вагенингена, Нидерланды. Для клонирования генетических конструкций использовалиштамм Escherichia coli DH5α.Для трансформации растений использовали штаммыAgrobacterium rhizogenes MSU440 и Arqua.Векторы и генетические конструкции.
Кодирующую и промоторную областиизучаемого гена клонировали в вектор pDONR221 (Invitrogen, США) с помощью BP-клоназы(Invitrogen, США). На последующем этапе кодирующую область переклонировали в векторpB7WG2D (конструкция для сверхэкспрессии гена под контролем промотора 35S) (VIBUGENT, Бельгия), а промоторную область переклонировали в вектор pBGWFS7,0 (VIBUGENT, Бельгия) (конструкция для анализа активности промотора, слитого с репортернымгеном GUS) с помощью LR-клоназы (Invitrogen, США).
Для подавления экспрессии генаMtKNOX3, фрагменты длиной 105 и 150 п.о. были клонированы в вектор pENTR-D-TOPO изатем переклонированы с помощью LR-клоназной системы в вектор pK7GWIWG2D (VIB5UGent, Бельгия). Последовательность гомеобокса гена MtKNOX3 (соответствуетаминокислотам с 359 по 426 из кодирующей области MtKNOX3), клонировали впромежуточном векторе pJET, и затем встраивали в вектор pPICZαA для наработкигомеодомена ТФ MtKNOX3 в дрожжах Pichia pastoris.Молекулярно-биологические процедуры. Выделение суммарной ДНК растенийпроводили с использованием коммерческого набора DNeasy (Qiagen, Германия) согласнопротоколу производителя.
Плазмидную ДНК выделяли из ночной культуры клеток E.coli спомощью набора для выделения плазмидной ДНК (Евроген, Россия). РНК выделяли сиспользованием набора RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколупроизводителя. Обработку ДНКазой проводили с использованием набора для удаления ДНК(RapidOut DNA Removal Kit, Thermo Fisher Scientific, США). Синтез кДНК проводили сравным количеством РНК во всех временных точках в каждом эксперименте (варьируя от 400нг до 1 мкг РНК в разных экспериментах) с использованием обратной транскриптазы RevertAid (Thermo Fisher Scientific, США). Количественный анализ экспрессии генов проводилипутем ПЦР в реальном времени с помощью системы Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad Laboratories,США).Трансформация растений с помощью A.
rhizogenes. Растения люцернытрансформировали с помощью штамм Agrobacterium rhizogenes, несущим генетическуюконструкцию 35S:MtKNOX3, pMtKNOX3:GUS или MtKNOX3-RNAi. Трансформациюосуществляли по протоколу, описанному Limpens и соавторами (Limpens, et al., 2004).Инокуляцию люцерны проводили с использованием штамма ризобий Sinorhizobium meliloti2011. Отбор трансгенных корней (в случае использования конструкций 35S: MtKNOX3 иMtKNOX3-RNAi) проводили с помощью флуоресцентного стереомикроскопа Leica M205FA вресурсном центре «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.Анализ сдвига электрофоретической подвижности (англ.
EMSA: ElectrophoreticMobility Shift Assay). Биотинилированные последовательности ДНК длиной 40 п.о былисинтезированы в фирме Beagle (http://www.biobeagle.com/ru). Реакцию отжига проводили в 50мкл реакционной смеси с 2X буфера для отжига (20 мМ TrisOH, 100 мМ NaCl, 2 мМ EDTA) втермоциклере по следующей программе: 98° С в течение 5 мин, затем от 97° С до 24° С (накаждой стадии температуру уменьшали на 1° С в течение одной минуты), 24° С в течение 30мин, после чего реакционные смеси оставляли при 4° С. После этого 10 фмоль/мклбиотинилированной двухцепочечной ДНК инкубировали с 0,5 - 8 мкг белка с использованиемнабора Light Shift Chemiluminescent EMSA Kit (ThermoScientific, США) в буфере длясвязывания EMSA (100 мМ Tris, 500 мМ KCl, 10 мМ DTT; pH 7,5) вместе с Poly dI-dC (1мкг/мкл в 10 мМ Tris, 1 мМ EDTA; pH 7,5) и 50% глицерол.
ДНК и белок инкубировали втечение часа при комнатной температуре. При проведении конкурентного анализа немеченуюдвухцепочечную ДНК добавляли в 2000-кратном избытке, по сравнению с меченой ДНК.Реакции связывания разделяли на 10% полиакриламидном геле (соотношение акриламида кбис-акриламиду 29: 1 с добавлением 3% глицерина) в 0,5x Трис-боратном-EDTA буфере.После электрофореза ДНК переносили на мембрану (Biodyne B Nylon Membrane, 8 см× 12 см,размер пор 0,4 мкм, Thermo Scientific США) с помощью блота (Mini Trans-Blot cell, Bio-Rad,США).
Биотинилированную ДНК на мембране детектировали с помощьюхемилюминесценции (Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit (Thermo Scientific,США) с использованием прибора Gene Gnome (SynGene, Великобритания).Анализ взаимодействия с помощью технологии поверхностного плазмонногорезонанса (англ. SPR, surface plasmon resonance). Взаимодействия междубиотинилированными олигонуклеотидами (лиганд) и очищенным белком (аналит-гомеодоменMtKNOX3) оценивали с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса сиспользованием прибора ProteOn XPR36 (Bio-Rad, США) в ресурсном центре «Развитиемолекулярных и клеточных технологий» СПбГУ. Биотинилированный двухцепочечныйолигонуклеотид с концентрацией 0,5-1 мкМ в буфере PBS/Tween (pH 7,4) иммобилизовали насенсорном микрочипе, покрытом нейтравидином (ProteOn NLC sensor chip, Bio-Rad, США)6при скорости потока (flow rate) 30 мкл/мин.
Взаимодействие оценивали при разныхконцентрациях белка (0, 1, 3, 5, 7 и 10 мкМ, белок разводили в буфере в PBS/Tween). В качествереакционного буфера (running buffer) использовали PBS/Tween. В качестве конкурента враствор белка добавляли немеченный двухцепочечный олигонуклеотид polуAT в 10-30кратном избытке, по сравнению с иммобилизированным олигонуклеотидом. Дляпредотвращения неспецифического связывания в раствор белка также добавляли БСА (SigmaAldrich, Германия) с концентрации 670 мкг/мл. Данные были получены с использованиемпрограммного обеспечения ProteOn (ProteOn manager software, Bio-Rad, США).
Кинетическийанализ проводили с использованием модели оценки langmuir (Langmuir, 1916 и 1918).Компьютерные программы и статистические методы, используемые в работе.Выравнивания нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы AlignX,использующую алгоритм Clustal W (Thompson, et al., 1994), из пакета Vector NTI Advance 10(InforMax Inc http://www.informaxinc.com, Thermo Scientific, США).
Для филогенетическогоанализа последовательности генов выравнивали в программе MEGA6 (Hall, 2013) сиспользованием алгоритма Clastal W. Филогенетическое дерево строили с использованиемметода максимального подобия на основе модели Tamura-Nei (Hall, 2013, Tamura and Nei,1993) с величиной выборки при бутстрэп-анализе (bootstrap value), равной 1000.Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ STATISTICA 6.0.Сравнение значений длины корня и числа клубеньков на корнях с РНК-интерференцией генаMtKNOX3 проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Уровни экспрессии генов вконтрольных корнях и в корнях с измененной экспрессией MtKNOX3, а также при обработкенитратом, сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (one-wayANOVA).Результаты и обсуждениеАнализ экспрессии генов семейства KNOX при клубенькообразовании1.1.
Количественный анализ экспрессии генов MtKNOX на разных стадиях развитияклубеньковВ геноме Medicago truncatula были идентифицированы десять генов из семейства KNOX(Di Giacomo, et al., 2008, Zhou, et al., 2014). Мы проанализировали экспрессию этих генов наразные дни после инокуляции ризобиями с помощью количественной ПЦР в реальномвремени и показали, что экспрессия гена MtKNOX3 увеличивается в значительно большейстепени, чем экспрессия других генов MtKNOX (Рисунок 1).
Кроме того, наблюдалинебольшое, по сравнению с MtKNOX3, увеличение экспрессии MtKNOX5 и MtKNOX9 в ответна инокуляцию. Экспрессия других проанализированных генов (MtKNOX 1,2,4,6,7,8,10)значительно не изменялась. Таким образом, для дальнейшей работы был выбран генMtKNOX3, экспрессия которого увеличивалась в ходе развития клубеньков в значительнобольшей степени, чем экспрессия других генов MtKNOX.Рисунок 1- Уровни экспрессии гена MtKNOX3 на разных сроках развития клубеньков (3-22дни после инокуляции (dpi), NI-5d и NI-7d–контроли без инокуляции).71.2.
Локальный анализ экспрессии гена MtKNOX3 при клубенькообразованииНа следующем этапе проводили локальный анализ экспрессии гена MtKNOX3 с помощьюрепортерного гена β-глюкуронидазы (GUS) (Рисунок 2). На ранних стадиях развитияклубеньков (3-5 дпи), активность промотора MtKNOX3 наблюдалась во внутренних слояхклеток коры, где происходят деления клеток при развитии клубеньков (рис. 2A).
Напоследующих стадиях развития (5-7 дпи) активность промотора MtKNOX3 наблюдалась впролиферирующих клетках примордия (рис. 2Б, Д, Е), а затем (12-15 дпи, рис 2Б, В) вапикальной зоне клубенька, где формируется меристема клубенька, а также в местеформирования будущих проводящих тканей. На поздних стадиях активность промотораMtKNOX3 наблюдали в периферической зоне клубенька (рис. 2Г).Рисунок 2 - Активность промотора MtKNOX3 в клубеньках растений, трансформированныхконструкцией pMtKNOX3:GUS (результат GUS-окрашивания). Масштабная шкала - 100 мкм.Толщина срезов, 50 мкм.2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
