Диссертация (1145924), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Однако в таких клубеньках с задержкой происходил процесс инфицирования.Таким образом, анализ мутантов по гену к1, а также анализ экспрессии гена впроцессе клубенькообразования позволяют сделать вывод о том, что К1 являетсярецептором, необходимым для развития симбиоза. Доказательства того, что у мутантов погену k1 именно с мутацией в этом гене может быть связан Nod- фенотип, были получены вэкспериментахпокомплементациимутантнойлинии817полноразмернойпоследовательностью этого гена исходной линии Cameor.Нас также интересовало, как могут взаимодействовать между собой рецепторыSym10, K1 в Sym37 при формировании симбиоза у гороха. С этой целью была изученавозможность формирования рецепторных комплексов в гетерологичных системах –листьях N.
benthamiana и дрожжевой двугибридной системе. Для синтеза изучаемыхрецепторов в листьях N. benthamiana были получены конструкции, кодирующиеполноразмерные последовательности генов и обеспечивающие высокий уровень синтезабелков в клетках растений. В данных конструкциях последовательности генов,кодирующие рецепторы, были слиты в одну рамку считывания с генами, кодирующимифлуоресцентные белки, для визуализации их синтеза в клетках растений. В результатетрансформации, обеспечивающей временный синтез белков в листьях N. benthamiana,были показано, что синтезируемые рецепторы встраиваются в цитоплазматическуюмембрану и имеют молекулярную массу, соответствующую ожидаемой.При совместном синтезе Sym10/K1 и Sym10/Sym37 в листьях было показано, чтодостаточно быстро развивается реакция гиперчувствительности, вызывающая гибельклетоклистьев(типичнаяреакцияиммунногоответаурастений).Реакциягиперчувствительности отсутствовала при моно-трансформации.
Развитие такой реакциипри синтезе рецепторов в гетерологичной системе (у не бобового растения) свидетельствуетоб их совместном участии в активации пути передачи сигнала, ведущего к развитиюиммунного ответа.Для анализа взаимодействия рецепторов в дрожжевой двугибридной системе былиполучены конструкции, кодирующие внеклеточные домены изучаемых рецепторов.
В этойсистеме было показано непосредственное взаимодействие внеклеточных доменовSym10/K1 и Sym10/Sym37. Это согласуется с данными, полученными при трансформациилистьев N. benthamiana, о способности рецепторов совместно активировать пути передачисигнала в клетке. Сравнительный анализ с использованием рецепторов, имеющих другоестроение (LRR-РПК) свидетельствует о наличии участков связывания во внеклеточных90доменахизучаемыхрецепторов,необходимыхдляформированиякомплексов.Наблюдаемое взаимодействие внеклеточных доменов Sym37 и K1 с CERK1, рецепторомArabidopsisк хитоолигосахаридам, может говорить о роли Sym37 и K1 не только в развитиибобово-ризобиального симбиоза, но и об их возможном участии в контроле симбиоза сгрибами арбускулярной микоризы и/или иммунном ответе растений.При проведении экспериментов по комплементации Nod- мутантов по гену sym37полноразмерной последовательностью гена К1 исходной линии Cameor наблюдаливосстановление функции клубенькообразования.
Однако полноразмерный ген Sym37 притрансформации мутантной линии 817 (дефектной по гену k1) не был способенвосстанавливать функцию гена К1. Это позволяет сделать вывод о том, что рецепторы K1и Sym37 выполняют разную функцию при развитии симбиоза и (или) работают на разныхэтапах развития симбиоза.На основе полученных данных была предложена модель, согласно которойраспознаваниеNod-факторовурастенийснедетерминированнымтипомклубенькообразования, в частности у гороха, происходит на двух разных этапах развитиясимбиоза.ФормированиегетероолигомерногокомплексаSym10/K1можетбытьнеобходимо для инициации развития симбиоза и активации ранних симбиотическихреакций. C формированием гетероолигомерного комплекса Sym10/ Sym37 связан контрольразвития инфекционных нитей. Следует отметить, что ранее для афганских линий гороха,несущих аллель sym2A (предполагаемый дополнительный рецептор к Nod-факторам), былопоказано нарушение развития симбиоза также на стадии инициации развитияинфекционных нитей при заражении европейскими штаммами ризобий.
В таком случаеразвитиеинфекцииугорохаможетконтролироватьсятрехкомпонентнымгетероолигомерным комплексом Sym10/Sym37/Sym2.Кроме того, на основании фенотипической характеристики мутантной линии 817 погену к1, у которой отсутствует выход бактерий из инфекционных нитей, а также данных покомплементациимутантовпогенуsym37полноразмернойкодирующейпоследовательностью гена К1, роль К1 может быть более сложной. Помимо участия винициации развития симбиоза эта LysM-РПК может контролировать эндоцитоз бактерийиз инфекционных нитей в ткани клубенька.
В таком случае, после формирования двухрецепторных комплексов, контролирующих начальные этапы развития симбиоза (комплексI) и инициацию роста инфекционных нитей (комплекс II), появление дополнительногосигнала может быть необходимо для эндоцитоза бактерий из инфекционных нитей, вконтроле которого вновь принимает участие рецептор К1.91В ходе изучения роли LysM-РПК К1 при развитии симбиоза была выявлена егоуникальная функция - контроль выхода ризобий из инфекционных нитей.
Сейчас одной изосновных задач в сельском хозяйстве стало увеличение круга растений, способныхобразовывать симбиоз с азотфиксирующими микроорганизмами (Oldroyd et al., 2014).Известно, что 80% растений способны формировать симбиоз с грибами арбускулярноймикоризы.
Как показывают исследования последних лет, в формирование симбиоза сризобиальными бактериями и грибами арбускулярной микоризы после рецептороввовлечены одни и те же гены, кодирующие регуляторы пути передачи сигнала внутрьклетки (Oldroyd et al., 2013). Вероятно, для создания растений, способных восприниматьсигналы азотфиксирующих бактерий, достаточно перенести в небобовые растения гены,работающие на самых ранних этапах развития ризобиального симбиоза. Одним изключевых таких генов может стать К1, кодирующий LysM-РПК, контролирующих какранние этапы развития симбиоза – так и более поздние – выход бактерий из инфекционныхнитей.92На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы:Выводы1.На основании анализа экспрессии гена К1 методом количественной ОТ-ПЦРпоказано, что этот ген необходим для развития симбиоза у гороха.2.С помощью TILINNG подхода выявлено 3 мутантных линии гороха 817, 885 и2265, несущих мутации в гене к1.
Фенотипическая характеристика мутантных линийпоказала, что LysM-рецептор-подобная киназа К1 необходима для инициации развитиясимбиоза у гороха, а также контролирует выход бактерий из инфекционных нитей.3.Показанавозможностьформированиягетероолигомерныхрецепторныхкомплексов между LysM- рецептор-подобными киназами K1 и Sym10, а также Sym10 иSym37 при совместном синтезе в листьях N.
benthamiana, а также в дрожжевойдвугибридной системе.4.Эксперименты по трансформации мутантов гороха по генам к1 и sym37конструкциями, содержащими полноразмерные последовательности этих генов, показали,что рецепторы K1 и Sym37 могут контролировать разные этапы развития симбиоза.5.Предложена новая модель функционирования рецепторов к Nod-факторам угороха с участием нескольких рецепторных комплексов.93Список литературы1.Кириенко,А.Особенностиорганизацииифункционированияурастенийуникального класса рецепторных киназ, содержащих LysM-мотивы во внеклеточныхдоменах /А.Кириенко, И.Леппянен, Е.А.Долгих//Экологическая генетика.
- 2013. – Т. 11. №4. – С.12-22.2.МедведевС.С.Кальциеваясигнальнаясистемарастений/C.C.Медведев//Физиология растений. – 2005. – V.52. –C. 11-24.3.Неманкин, Т.А. Анализ генетической системы гороха (Pisum sativum L.),контролирующей развитие арбускулярной микоризы и азотфиксирующего симбиоза:диссертация ... кандидата биологических наук: 03.02.03, 03.02.07 / Неманкин ТимофейАлександрович; [Место защиты: С.-Петерб. гос.
ун-т] Санкт-Петербург, 2011 134 c. : 61 123/1024.Разумовская З. Г. Образование клубеньков у различных сортов гороха //Микробиология. 1937. Т. 6. № 3. С. 321-328.5.Проворов, Н. А.Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозоврастений с микробами-азотфиксаторами и эндомикоризными грибами / Н.А.Проворов,А.Ю.Борисов, И.А.Тихонович // Журнал общей биологии. – 2002. - Т.
63. - С. 451–472.6.Abas, L. Intracellular trafficking and proteolysis of the Arabidopsisauxin-efflux facilitatorPIN2 are involved in root gravitropism / L. Abas, R. Benjamins, N. Malenic, T. Paciorek, J.Wiśniewska, J. Moulinier-Anzola, T. Sieberer, J. Friml, C. Luschnig//Nat. Cell Biol. - 2006. – V.8.– P. 249–256.7.Albrecht, C. Legume nodulation and mycorrhizal formation; two extremes in hostspecificity meet /C.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
