Автореферат (1145916), страница 3
Текст из файла (страница 3)
После появления соматических эмбрионов можно былодетектировать интенсивную активность промотора STF непосредственно в зародышах настадиях глобулы и сердца; кроме того, активность промотора мы наблюдали в зонах наповерхности каллуса, находящихся рядом с соматическими эмбрионами (Рисунок 3, в, г).Следует также заметить, что часть соматических эмбрионов не демонстрировала наличиеэкспрессии репортерного гена.Рисунок 3.
Экспрессия конструкции STF:GUS в ходе развития эмбриогенных каллусов.Наличие сине-голубого окрашивания указывает на экспрессию репортерного гена GUS. (а)Каллус на ранней стадии развития (14 день культивации). (б) Развившийся каллус (40 денькультивации) перед пересадкой на безгормональную среду. (в)-(г) Каллусы с соматическимиэмбрионами (59-72 день культивации). Чёрными стрелками указаны окрашенныесоматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца и семядолей, в которых присутствуетэкспрессия репортерного гена.Аналогичные результаты были получены и для промотора гена MtWOX9-1: на раннихэтапах развития каллуса активность промотора была близка к нулевой (Рисунок 4, а). Вразвившемся каллусе промотор MtWOX9-1 активировался на небольших участках наповерхности каллуса, при этом зоны активации были более размытыми, чем в случаепромотора STF (Рисунок 4, б). При появлении соматических эмбрионов мы обнаружилиактивность промотора непосредственно в зародышах на стадии глобулы, сердца исемядолей, а также в расположенных рядом зонах (Рисунок 4, в-г).
Как и в случае с геномSTF, в некоторых соматических эмбрионах активность промотора MtWOX9-1 ненаблюдаласьРисунок 4. Экспрессия конструкции MtWOX9-1:GUS в ходе развития эмбриогенныхкаллусов. Наличие сине-голубого окрашивания указывает на экспрессию репортерного генаGUS. (а) Каллус на ранней стадии развития (15 день культивации).
(б) Развившийся каллус(34 день культивации) перед пересадкой на безгормональную среду. (в)-(ж) Каллусы ссоматическими эмбрионами (60-81 день культивации). Чёрными стрелками указаныокрашенные соматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца и семядолей, в которыхприсутствует экспрессия репортерного гена.Промотор гена SLM1 проявлял максимальную активность на этапе формированиякаллуса, когда экспланты культивировали на среде с ауксином. В развившемся каллусезоны экспрессии сужались до небольших участков на поверхности, и впоследствии былазаметна активность промотора непосредственно в соматических эмбрионах, а также вассоциированных с ними зонах (Рисунок 5).Рисунок 5.
Экспрессия конструкции pSLM1:GUS в ходе развития эмбриогенных каллусов.Наличие сине-голубого окрашивания указывает на экспрессию репортерного гена GUS. (а)Развившийся каллус (34 день культивации) перед пересадкой на безгормональную среду. (б)Каллус после 14 дней культивирования на безгормональной среде (44 день культивации). (в)Каллус с соматическими эмбрионами (59 день культивации). Чёрными стрелками указаныокрашенные соматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца и семядолей, в которыхприсутствует экспрессия репортерного гена.Таким образом, результаты локального анализа активности промоторов трёхисследованных генов (STF, MtWOX9-1 и SLM1) согласуются с результатами анализаэкспрессии с помощью ПЦР-РВ.
Согласно локальному анализу, все три генаэкспрессируются в соматических эмбрионах, т.е., как мы и предполагали, являютсяучастниками СЭ.2.2. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессииисследуемых генов WOX и PINДля изучения влияния исследуемых нами генов на процесс СЭ мы проанализировалирастения со сверхэкспрессией, а также с потерей функции исследуемых генов.2.2.1. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессии генаSTFМы получили каллусы растений со сверхэкспрессией STF и сравнили интенсивность СЭс таковой у каллусов растений дикого типа. Было проанализировано 34 каллуса сосверхэкспрессией STF и 35 каллусов дикого типа.Эмбрионы, видимые невооружённым глазом, выглядят как зелёные образования наповерхности жёлтого каллуса (Рисунок 6, а).
Оценка количества эмбрионов достаточнозатруднительна, так как их может быть очень много, и они часто сливаются друг с другом.Поэтому для оценки мы фотографировали каллусы и оценивали долю видимой поверхностикаллуса, окрашенную в зелёный, с помощью программы ImageJ. Анализ показал наличиестатистически значимых различий по этому параметру между каллусами дикого типа икаллусами со сверхэкспрессией (p<0,01) (Рисунок 6, б).Рисунок 6. (а) Каллусы с образующимися соматическими эмбрионами.
Верхний ряд —каллусы дикого типа. Нижний ряд — каллусы со сверхэкспрессией STF. (б) Средняя доляповерхности каллуса, занимаемая эмбрионами, у каллусов дикого типа и каллусов сосверхэкспрессией STF. Ошибки отражают доверительные интервалы, рассчитанные спомощью t-критерия Стьюдента (уровень значимости 0,05).Таким образом, сверхэкспрессия гена STF приводит к увеличению интенсивности СЭ.STF является транскрипционным фактором, поэтому, вероятнее всего, увеличиваетэмбриогенность за счёт изменения уровней экспрессии каких-либо генов-мишеней, тем илииным образом задействованных в СЭУ Medicago truncatula уже выявлено несколько участников СЭ, например, ген MtSERK1(Nolan et al.,2009), однако как и в случае других объектов, очевидно, что их список далеконе полон.C целью выявления предполагаемых мишеней ТФ STF в СЭ, мы провели поиск новыхучастников СЭ у Medicago truncatula среди генов-гомологов известных участниковсоматического или зиготического эмбриогенеза у A.
thaliana. Для анализа мы выбрали 7генов A. thaliana: MONOPTEROS (MP), SCARECROW (SCR), SHORT-ROOT (SHR),CUP-SHAPED COTYLEDON 2 (CUC2) (De Smet et al., 2010), LEAFY COTYLEDON1 (LEC1),BABYBOOM1 (BBM1) и AGAMOUS-like 15 (AGL15) (Radoeva, Weijers, 2014). С помощьюбазы данных Phytozome мы нашли гены M. truncatula, являющиеся близкими гомологамиперечисленных выше генов A.
thaliana (MtMONOPTEROS, MtSCARECROW,MtSHORT-ROOT, MtCUP-SHAPED COTYLEDON 2, MtLEAFY COTYLEDON1A,MtBABYBOOM1, MtAGAMOUS-like 15. Затем с помощью ПЦР-РВ мы измерили динамикуих экспрессии в ходе СЭ. Как и для генов WOX и PIN, в этом эксперименте мывоспользовались линиями 2HA и A17, контрастными по признаку эмбриогенности (см.главу 1 раздела «Результаты и обсуждение».Для 4 из перечисленных выше 7 генов (MtMP, MtSCR, MtCUC2 и MtBBM1) мы не выявилизначительного увеличения уровня экспрессии, связанного с СЭ (данные не представлены),однако три других гена (MtSHR, MtLEC1A и MtAGL15) продемонстрировали активациюэкспрессии на этапе формирования соматических эмбрионов (Рисунок 7).Рисунок 7.
Динамика экспрессии MtSHR (а), MtAGL15 (б) и MtLEC1A (в) в ходе культивацииэксплантов эмбриогенной линии 2HA (сплошная линия) и неэмбриогенной линии A17(пунктирная линия) в условиях, способствующих появлению соматических зародышей.Эксперимент был проведён в двух биологических повторностях, в них наблюдалась сходнаядинамика экспрессии исследуемого гена. На рисунке представлена одна серия проб, планкипогрешностей указывают стандартные отклонения, рассчитанные для трёх аналитическихповторностей.С целью выявления причин повышенной эмбриогенности каллусов со сверхэкспрессиейSTF мы измерили уровни экспрессии этих и некоторых других генов, предположительноассоциированных с СЭ, а также генов, участвующих в работе фитогормонов, в каллусах сосверхэкспрессией STF и сравнили их с таковыми в каллусах дикого типа на стадииформирования соматических зародышей (60 дней с момента начала культивирования),когда различия между двумя типами каллусов были наиболее заметны.В результате мы обнаружили, что в каллусах со сверхэкспрессией STF снижен уровеньэкспрессии гена MtGH3.6, регулирующего метаболизм ауксина (Рисунок 8, а) (Yang et al.,2015).Рисунок 8.
Экспрессиягенов MtGH3.6 и MtHB1 вкаллусах а-б: ЭкспрессияMtGH3.6 (а) и MtHB1 (б) вкаллусах дикого типа и вкаллусахсосверхэкспрессиейSTF,полученных из листовыхэксплантов. Экспериментпроводили в двух или трёхбиологическихповторностях.Планкипогрешностей указываютстандартные отклонения.в-г: динамика экспрессииMtGH3.6 (в) и MtHB1 (г) входе культивации эксплантов эмбриогенной линии 2HA (сплошная линия) и неэмбриогеннойлинии A17 (пунктирная линия) в условиях, способствующих появлению соматическихэмбрионов Эксперимент был проведён в двух биологических повторностях, в нихнаблюдалась сходная динамика экспрессии исследуемого гена.
На рисунке представленаодна серия проб, планки погрешностей указывают стандартные отклонения, рассчитанныедля трёх аналитических повторностей.Мы проанализировали динамику экспрессии MtGH3.6 в ходе СЭ. Данный экспериментпроводили с эмбриогенной линией 2HA и неэмбриогенной линией A17, аналогичноэкспериментам с генами WOX и PIN (см. главу 1 раздела «Результаты и обсуждение»). Мывыявили повышенный уровень экспрессии MtGH3.6 в линии A17 по сравнению с линией2HA на поздних стадиях культивирования, соответствующих развитию соматическихзародышей у эмбриогенной линии (Рисунок 8, в). Таким образом, пониженный уровеньэкспрессии MtGH3.6 ассоциирован с повышением эмбриогенности, как в случае каллусовсо сверхэкспрессией STF, так и в случае каллусов эмбриогенной линии 2HA.Помимо этого, мы обнаружили, что в каллусах со сверхэкспрессией STF уменьшенуровень экспрессии гена MtHOMEOBOX PROTEIN1 (MtHB1), кодирующего ТФ,предположительно, участвующий в сигналинге абсцизовой кислоты (Ariel et al., 2010)(Рисунок 8, б).
Мы также проанализировали динамику экспрессии MtHB1 в ходекультивирования in vitro в каллусах эмбриогенной линии 2HA и неэмбриогенной линии A17и обнаружили, что этот ген демонстрирует повышенные уровни экспрессии на позднихстадиях культивирования каллусов обеих линий. Однако, в каллусах линии A17наблюдаемое повышение было более существенным по сравнению с каллусами линии 2HA(Рисунок 8, г). Таким образом, более интенсивная транскрипция MtHB1 ассоциирована сразвитием неэмбриогенного каллуса.Таким образом, мы провели сравнительный анализ экспрессии 25 предполагаемыхгенов-мишеней в каллусах дикого типа и в каллусах с приобретением функции STF настадии формирования соматических зародышей. В результате, несмотря на статистическизначимые различия в интенсивности СЭ между каллусами разных генотипов, мыобнаружили только два гена, уровни экспрессии которых различались в каллусах дикоготипа и в каллусах со сверхэкспрессией STF.Поскольку оба выявленных гена (MtHB1 и MtGH3.6) связаны с работой фитогормонов,мы предполагаем, что сверхэкспрессия STF приводит к изменению гормонального балансакаллуса в целом или к перераспределению тех или иных гормонов внутри каллуса, что иповышает интенсивность СЭ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
