Автореферат (1145916), страница 2
Текст из файла (страница 2)
truncatula линии R-108 совстроенными в геном конструкциями для сверхэкспрессии гена STENOFOLIA (STF) и дляанализа экспрессии генов STF и MtWOX9-1, трансгенные растения для анализа экспрессиигена SMOOTH LEAF MARGIN1, а также растения из коллекции инсерционных мутантовMedicago truncatula Института Сэмюэля Робертса, США, линий NF0075, NF8274 иNF7292. Кроме того, в работе использовали растения Nicotiana benthamiana (семеналюбезно предоставлены доктором Миллионом Тадеге).Условия выращивания растений. Растения выращивали в условиях in vitro и in vivo притемпературе 21º-23ºС, с продолжительностью дня и ночи 16 и 8 часов и с освещённостью2500 люкс. Растения in vivo выращивали в вермикулите, который поливали раз в двенедели модифицированным раствором солей Fahraeus (Fahraeus et al., 1957) или вуниверсальном питательном грунте Terra Vita (Фарт, Россия).
Для культивированиярастений in vitro использовали модифицированные среды Fahraeus (Fahraeus et al., 1957),SH (Hoffmann et al., 1997) и P4 (Chen et al., 2009). Для получения соматических эмбрионовиспользовали протоколы Hoffmann et al., 1997 и Chen, 2009. Оценку интенсивности СЭ укаллусов линии R-108 проводили на 60 день культивирования.Штаммы микроорганизмов.
В работе использованы бактерии Escherichia coli (штаммDH5α), Agrobacterium tumefaciens (штаммы AGL1 и GW2260), а также дрожжиSaccharomyces cerevisiae (штамм Y2H Gold).Молекулярно-биологические методы. Для клонирования последовательностей ДНКпользовались системой Gateway (Invitrogen, США). Растительную РНК выделяли спомощью кита RNeasy Micro Kit (Qiagen, Германия) или с помощью реагента Purezol(Bio-Rad, США). Обратную транскрипцию РНК проводили с помощью обратнойтранскриптазы RevertAid (Thermo Scientific, США). Для ПЦР в реальном времени(ПЦР-РВ) использовали набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителяEva Green (Синтол, Россия). Количественную оценку экспрессии анализируемого генапроводили по методу 2-ΔΔСt (Livak, Schmittgen, 2001). В качестве референсных геновиспользовалигеныубиквитина(XM_003627103/MTR_8g018230)илиактина(XM_003602497/MTR_3g095530). Выделение ДНК из растений для клонированияосуществляли с помощью метода с использованием буфера, содержащегоцетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ) (Murray, Thompson, 1980).
Выделение плазмиднойДНК из бактерий осуществляли с помощью набора Plasmid Miniprep (Евроген, Россия).Эксперименты с использованием дрожжевой двугибридной системы и бимолекулярнойфлуоресцентной комплементации проводили согласно Lu et al., 2010.Визуализация экспрессии генов. Детекцию активности репортерного гена GUSосуществляли c помощью субстрата X-Gluc (Thermo Scientific) согласно Chen, 2009.Статистические методы и компьютерные программы, используемые в работе. Дляработы с последовательностями ДНК использовали программы Vector NTI Advance 10(Thermo Scientific) и ApE (M.
Wayne Davis). Для оценки доли видимой поверхностикаллуса, покрытой соматическими эмбрионами, использовали программу ImageJ(Schneider et al., 2012). Статистическую значимость различий в уровнях экспрессииоценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Статистическую значимость различий впроцентах площади каллуса, покрытой соматическими эмбрионами, оценивали с помощьюкритерия Манна-Уитни.Результаты и обсуждение1. Выявление генов WOX и PIN, экспрессирующихся в ходе соматическогоэмбриогенезаМы решили начать поиск новых регуляторов СЭ среди генов PIN, участвующих в раннихэтапах ЗЭ, а также в развитии тканей, окружающих эмбрион. Исходя из этого, первойпоставленной задачей было выявление генов PIN, которые могут участвовать в развитиисемязачатков и в ЗЭ у M.
truncatula.У M. truncatula выделено всего 10 генов PIN (MtPIN1-MtPIN10), семь из которых(MtPIN1-5, MtPIN7 и MtPIN10, или SMOOTH LEAF MARGIN1(SLM1)) принадлежат к группедлинных PIN, т.е., по-видимому, кодируют транспортёры, которые локализованы наплазмалемме и обеспечивают межклеточный транспорт ауксина. Для выявления тех геновдлинных PIN, которые специфично экспрессируются в семязачатках, мы сравнили уровеньэкспрессии генов PIN в семязачатках с их уровнем экспрессии во взрослом растении M.truncatula (линия 2HA) на вегетативной стадии развития (данную пробу использовали вкачестве контроля), который мы приняли равным единице. Гены MtPIN2, 3, 5 и 7продемонстрировали более низкий уровень экспрессии в семязачатках по сравнению суровнем экспрессии во взрослом растении.
У двух генов (MtPIN1 и 4) различие междудвумя пробами было выражено незначительно. У одного гена – MtPIN10 (SLM1) – уровеньэкспрессии в семязачатках был значительно выше.Таким образом, исходя из вышеизложенных данных, мы заключили, что уровеньтранскрипции генов MtPIN1, MtPIN4 и MtPIN10 (SLM1) повышен в семязачатках и,предположительно, эти гены являются участниками ЗЭ у M.
truncatula.Далее мы измерили уровни экспрессии генов длинных MtPIN в ходе СЭ. Данныйэксперимент проводили с эмбриогенной линией 2HA и неэмбриогенной линией A17.Листовые экспланты культивировали на твёрдой среде с концентрацией НУК 10 мкМ иБАП 4 мкМ в течение трёх недель — в это время формировались каллусы. С четвёртой пошестую недели полученные каллусы культивировали на среде без гормонов, и в это времяна каллусах линии 2HA образовывались соматические эмбрионы.Для генов MtPIN1 и MtPIN4 мы не выявили статистически значимых различий,связанных с формированием соматических эмбрионов (данные не представлены).
ГенMtPIN10 (SLM1) продемонстрировал повышенный уровень экспрессии у неэмбриогеннойлинии A17 по сравнению с линией 2HA в ходе формирования каллуса (1-3 недели), однакона более поздних сроках (6 недель), которые соответствуют развитию соматическихэмбрионов, было отмечено статистически значимое увеличение уровня транскрипции этогогена у эмбриогенной линии по сравнению с линией A17 (Рисунок 1).Таким же образом мы проанализировали экспрессию тех генов MtPIN, для которых небыл выявлен повышенный уровень транскрипции в семязачатках: MtPIN2, 3, 5 и 7.
Мы невыявили значительного повышения уровня экспрессии MtPIN2,3 и 5 в ходе СЭ. ЭкспрессиюMtPIN7 в данных условиях нам не удалось детектировать (данные не представлены)Рисунок 1. Изменение относительных уровнейэкспрессии гена MtPIN10 (SLM1) в условиях,способствующих СЭ, у эмбриогенной линии2HA и неэмбриогенной линии A17 (0,1, 2, 3, 4, 5и 6 недель). Эксперимент проводился в трёхбиологическихповторностях.Планкипогрешностейуказываютдоверительныеинтервалы, рассчитанные на основанииt-распределения Стьюдента для уровнязначимости 0,05.Аналогичныеэкспериментыбылипроведены и для генов WOX. У M.
truncatulaизвестно 12 генов WOX (Chen et al., 2009), и к настоящему моменту исследовано участиетрёх из них в СЭ. MtWUSCHEL (MTR_5g021930) и MtWOX9-like (MTR_7g026130) являютсяважными участниками СЭ и экспрессируются в каллусах и в образующихся соматическихэмбрионах (Chen et al., 2009, Kurdyukov et al., 2014). MtWOX5 (MTR_5g081990) такжеактивируется в соматических эмбрионах, и его экспрессия в основном ассоциирована срегенерацией корней (Chen et al., 2009).Мы выбрали для исследования по два гена WOX из каждой эволюционной ветвисемейства WOX: MTR_1g115315 и MTR_3g115620 (древняя ветвь), MTR_7g086940(MtWOX11-like) и MTR_2g015000 (MtWOX9-1) (промежуточная ветвь), а такжеMTR_1g019130 (MtWOX4-like) и MTR_8g107210 (STENOFOLIA, или STF) (ветвь WUS).Ранее их роль в СЭ не была изучена.
Как и для генов PIN, c помощью ПЦР-РВ мы сравнилиуровень экспрессии генов MtWOX в семязачатках с их уровнем экспрессии во взросломрастении M. truncatula на вегетативной стадии развития.У трёх генов WOX (MtWOX4-like, MTR_1g115315, MTR_3g115620) уровень экспрессии всемязачатках был ниже такового во взрослом растении. У гена MtWOX11-like различиямежду двумя этими пробами были небольшими, и, наконец, у двух генов – STF и MtWOX9-1– уровень экспрессии в семязачатках был значительно выше.На основании вышеизложенного мы заключили, что в семязачатках повышается уровеньтранскрипции генов MtWOX11-like, STF и MtWOX9-1.Как и для генов PIN, далее мы проверили уровни экспрессии этих генов WOX в условиях,способствующих развитию соматических эмбрионов. Уровень экспрессии гена MtWOX9-1 входе СЭ значительно повышался (Рисунок 2, а).
Гены STF и MtWOX11-like такжепродемонстрировали статистически значимое увеличение уровня экспрессии на стадиях,соответствующих развитию соматических эмбрионов, у эмбриогенной линии (Рисунок 2, б,в).Помимо этого, мы проанализировали экспрессию в тех же условиях остальных трёхисследуемых генов WOX: MTR_1g115315, MTR_3g115620 и MtWOX4-like. Мы не выявилиповышения уровня экспрессии, ассоциированного с СЭ, у этих генов (данные непредставлены).Рисунок 2. Изменение относительных уровней экспрессии генов MtWOX9-1 (а), STF (б), иMtWOX11-like (в) в условиях, способствующих СЭ, у эмбриогенной линии 2HA инеэмбриогенной линии A17 (0,1, 2, 3, 4, 5 и 6 недель). Эксперимент проводился в трёхбиологических повторностях. Планки погрешностей указывают доверительные интервалы,рассчитанные на основании t-распределения Стьюдента для уровня значимости 0,05.Таким образом, согласно нашим данным, из шести генов WOX и PIN с повышеннымуровнем экспрессии в семязачатках четыре (SLM1, MtWOX9-1, STF, MtWOX11-like)активируются в ходе СЭ.
В то же время, из семи генов WOX и PIN со сниженным уровнемэкспрессии в семязачатках ни один не активируется в ходе СЭ. Эти результаты позволяютпредположить, что ранние этапы СЭ и ЗЭ контролируются с участием одних и тех же геновWOX и PIN.2. Изучение функций исследуемых генов в СЭ2.1. Визуализация экспрессии исследуемых генов WOX и PINДля локального анализа экспрессии мы использовали растения M. truncatula линииR-108, трансформированные конструкциями pSTF:GUS (Tadege et al., 2011),pMtWOX9-1:GUS, а также pSLM1:GUS (Zhou et al., 2011a), в которых промоторы этихгенов регулируют экспрессию репортерного гена GUS (ген β-глюкуронидазы).
Семенарастений с конструкциями pSTF:GUS и pMtWOX9-1:GUS были любезно предоставленыдоктором Миллионом Тадеге (Государственный Университет Оклахомы, США). Семенарастений с конструкцией pSLM1:GUS были любезно предоставлены коллегами изИнститута Сэмюэля Робертса .Мы получили каллусы растений с конструкцией pSTF:GUS, на которых образовалисьсоматические эмбрионы, и подвергли их GUS-окрашиванию.На начальных стадиях развития каллуса активность промотора гена STF практическиотсутствовала (Рисунок 3, а). Активацию промотора наблюдали в уже развившемсякаллусе, непосредственно перед пересадкой на безгормональную среду. Зоны активациивыглядели как точки на поверхности каллуса (Рисунок 3, б). В ходе дальнейшейкультивации на безгормональной среде зоны активации промотора на поверхности каллусастановились более обширными.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
