Автореферат (1145916), страница 4
Текст из файла (страница 4)
При этом изменения в экспрессии других генов,ассоциированных с СЭ, также имеют место в каллусах со сверхэкспрессией STF, однакоони происходят только на поверхности каллуса – там, где формируются соматическиеэмбрионы, поэтому их невозможно выявить, измеряя уровень экспрессии в каллусахцеликом.Аналогичный эксперимент мы провели, используя каллусы растений с потерей функциигена STF (генотип stf) (25 шт.) и, в качестве контроля, каллусы дикого типа (29 шт.) Кнашему удивлению, потеря функции STF не снизила эмбриогенность каллусов и дажепривела к небольшому увеличению степени эмбриогенности (p<0,05) (данные непредставлены).Мы также измерили уровни экспрессии 25 предполагаемых генов-мишеней STF в СЭ вэтих каллусах и сравнили их с таковыми в каллусах дикого типа на стадии 60 дней смомента начала культивирования, однако различий не выявили (данные не представлены).Таким образом, в результате анализа интенсивности СЭ у растений со сверхэкспрессиейи с потерей функции гена STF, мы показали, что приобретение функции STF приводит кувеличению эмбриогенности, а потеря функции STF не снижает эмбриогенность.Следовательно, хотя STF, вероятнее всего, участвует в СЭ, его функции не являютсянеобходимыми для этого процесса.2.2.2.
Анализ способностей к СЭ у растений со сверхэкспрессией гена MtWOX9-1Мы получили каллусы растений со сверхэкспрессией MtWOX9-1 и сравнилиинтенсивность СЭ у них с таковой у каллусов растений дикого типа. Былопроанализировано 20 каллусов со сверхэкспрессией MtWOX9-1 и 24 каллуса дикого типа.Интенсивность СЭ, измеренная аналогично предыдущим экспериментам, у каллусов сосверхэкспрессией MtWOX9-1 была приблизительно в два раза выше, чем у каллусов дикоготипа (p<0,01) (Рисунок 9).Рисунок 9. (а) Каллусы собразующимисясоматическимиэмбрионами(60денькультивации).Верхнийряд—каллусысосверхэкспрессиейMtWOX9-1.
Нижний ряд —каллусы дикого типа. (б)Средняя доля поверхности каллуса, занимаемая эмбрионами, у каллусов дикого типа икаллусов со сверхэкспрессией MtWOX9-1. Ошибки отражают доверительные интервалы,рассчитанные с помощью t-критерия Стьюдента (уровень значимости 0,05).С целью поиска предполагаемых генов-мишеней MtWOX9-1 в ходе СЭ, мы измерилиуровни экспрессии нескольких генов, экспрессия которых, согласно нашим данным,ассоциирована с СЭ, на стадиях 30 и 60 дней с момента начала культивации. Мы взяли ванализ следующие гены: MtWOX11-like, STF, SLM1, MtAGL15, MtSHR и MtLEC1A. Вотличие от каллусов с изменённым уровнем экспрессии гена STF, в данном случае всеанализируемые нами гены изменяли характер экспрессии в каллусах со сверхэкспрессиейMtWOX9-1 (Рисунок 10).Рисунок 10. Уровни экспрессии генов MtWOX11-like (а), STF (б), SLM1 (в), MtAGL15 (г),MtSHR (д), MtLEC1A (е) в каллусах дикого типа (серые столбцы) и каллусах сосверхэкспрессией MtWOX9-1 (белые столбцы) на сроках культивирования 30 дней и 60 дней.Планки погрешностей указывают стандартные отклонения.
Эксперимент проводили в двухбиологических повторностях.В настоящий момент сложно сказать, является ли какой-либо из исследованных геновмишенью MtWOX9-1 в ходе СЭ. Скорее всего, изменения уровня экспрессии большинстваих них являются следствием изменённого состояния каллуса, а не непосредственнойактивации транскрипции за счёт MtWOX9-1.Дальнейший более подробный анализ, в частности, полный анализ транскриптомакаллуса со сверхэкспрессией MtWOX9-1, позволит выявить другие гены с изменённойэкспрессией и, возможно, мишени этого ТФ.2.2.3.
Анализ способностей к СЭ у растений с потерей функции гена MtWOX11-likeДля изучения функций гена MtWOX11-like мы приобрели семена растений,предположительно содержащих вставку транспозона Tnt1 в этом гене, из коллекцииинсерционных мутантов M. truncatula (http://medicago-mutant.noble.org/mutant/) (Tadege etal., 2008) – линию NF8274. Затем с помощью генотипирования мы выявили растения,гомозиготные по потере функции MtWOX11-likeМы получили каллусы этих растений и сравнили интенсивность СЭ с таковой у каллусоврастений дикого типа. Было проанализировано 60 каллусов mtwox11-like и 17 каллусовдикого типа. Нам не удалось выявить каких-либо различий в интенсивности СЭ междумутантными растениями и диким типом (данные не представлены).Таким образом, несмотря на активацию экспресcии в ходе СЭ, функции MtWOX11-like неявляются необходимыми для этого процесса.
Возможно, другие ТФ из семейства WOXвыполняют ту же роль в СЭ и замещают действие MtWOX11-like в случае потери егофункции.2.3. Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционными факторами STF иMtWOX9-1 и важных для СЭС помощью дрожжевой двугибридной системы мы проверили взаимодействие ТФ STF иMtWOX9-1 с другими ТФ, которые, предположительно, участвуют в эмбриогенезе. Мывыбрали гены M.
truncatula MtBBM1 (Medtr7g080460), MtBBM3 (Medtr4g065370),MtAGL15A (Medtr4g109830), MtSHR (Medtr4g097080), MtLEC1A(Medtr1g039040),MtMINI3(Medtr3g009470), MtFUS3(Medtr7g059330), близкие гомологи соответствующихгенов A. thaliana, согласно базе данных Phytozome.Согласно полученным нами данным, STF и WOX9-1 не взаимодействуют с MtBBM1,MtBBM3, MtMINI3, MtFUS3, MtSHR и MtAGL15, однако они оба взаимодействуют сMtLEC1A (Рисунок 11). Наблюдаемое взаимодействие STF и WOX9-1 с MtLEC1A, повидимому, не является ложноположительным результатом, поскольку аналогичныйэксперимент, проведённый с вектором, содержащим кодирующую область MtLEC1A, иконтрольным вектором (pGBKT7), не привёл к росту колоний дрожжей на селективнойсреде (данные не представлены).Рисунок 11.
Результаты анализа взаимодействия белков с использованием дрожжевойдвугибридной системы. Рост колонии S. cerevisiae на селективной среде указывает навзаимодействие указанных в таблице белков.Далее мы проверили взаимодействие STF и MtWOX9-1 с MtLEC1A с помощью методаBiFC (бимолекулярная флуоресцентная комплементация). Для этого мы клонироваликодирующую последовательность гена MtLEC1A в векторы pEarleygate201-YN иpEarleygate202-YC, присоединив таким образом к ней последовательность, кодирующуюлибо N-терминальный, либо C-терминальный фрагмент флуоресцентного белка YFP.ПлазмидыpEarleygate201-YN+STF,pEarleygate202-YC+STF,pEarleygate201-YN+MtWOX9-1, pEarleygate202-YC+MtWOX9-1, содержащие N- илиС-терминальные фрагменты YFP и кодирующие последовательности генов STF иMtWOX9-1, были любезно предоставлены доктором Миллионом Тадеге, ГосударственныйУниверситет Оклахомы, США).Затем мы трансформировали листья Nicotiana benthamiana четырьмя сочетаниями этихплазмид:1) pEarleygate201-YN+MtWOX9-1 и pEarleygate202-YC+MtLEC1A2) pEarleygate202-YC+ MtWOX9-1 и pEarleygate201-YN+MtLEC1A3) pEarleygate201-YN+STF и pEarleygate202-YC+MtLEC1A4) pEarleygate202-YC+STF и pEarleygate201-YN+ MtLEC1AТаким образом, в случае взаимодействия анализируемых в клетках табака образовывалсябы полноценный белок YFP, способный к свечению.Полученные результаты не подтвердили взаимодействие STF и MtLEC1A (данные непредставлены), однако взаимодействие MtWOX9-1 и MtLEC1A подтвердилось в обоихисследованныхсочетаниях(MtWOX9-1+С-терминальныйконецYFPиMtLEC1A+N-терминальный конец YFP, и наоборот) (Рисунок 12).Рисунок 12.
Результаты бимолекулярной флуоресцентной комплементации. а. Клетки N.benthamiana, трансформированные конструкциями pEarleygate201-YN+MtWOX9-1 иpEarleygate202-YC+MtLEC1A.б.КлеткиN.benthamiana,трансформированныеконструкциями pEarleygate202-YC+ MtWOX9-1 и pEarleygate201-YN+MtLEC1A. Желтоесвечение ядер указывает на образование функционального белка YFP вследствиевзаимодействия указанных транскрипционных факторов.Таким образом, MtWOX9-1 взаимодействует с MtLEC1A в клетках растений.2.3.1. Анализ функций гена MtLEC1A в СЭДля изучения функций гена MtLEC1A мы приобрели семена растений,предположительно содержащих вставку транспозона Tnt1 в этом гене, из коллекцииинсерционных мутантов M.
truncatula (http://medicago-mutant.noble.org/mutant/) (Tadege etal., 2008) – линию NF7292.С помощью генотипирования имеющихся у нас растений линии NF7292 мы получили дварастения, являющихся гомозиготными мутантами по гену MtLEC1A. Одно из двухполученных гомозиготных растений было стерильным.Интенсивность СЭ у растений с потерей функции MtLEC1A была значительно снижена.Из 17 каллусов с потерей функции MtLEC1A, на 60 день после начала культивации лишь 2каллуса имели соматические эмбрионы, в то время как из 23 каллусов растений дикого типав этом эксперименте на таких сроках соматические эмбрионы наблюдались на 21 каллусе(Рисунок 13).Рисунок 13. Оценка способностей к СЭ у растений спотерей функции гена MtLEC1A (а) Каллусы дикого типа(65 дней после начала культивации) (б) Каллусы mtlec1a(65 дней после начала культивации).Полученные данные позволяют предполагать наличиеважной роли MtLEC1A в СЭ, но не доказывают его.Растения из используемой нами коллекции мутантовсодержат вставки транспозона Tnt1 во множестве локусов,и существует возможность того, что мутантный фенотипопосредован наличием вставки в каком-либо другом местегенома.
Анализ большей выборки мутантов, а также вставка в геном мутантовфункциональной копии MtLEC1A помогут подтвердить или опровергнуть нашипредположения.Близким гомологом гена MtLEC1A является ген LEC1 A. thaliana, для которого былопоказано непосредственное участие в развитии эмбриона.LEC1 является одним из немногих ТФ, которые определяют не только развитиеопределённых органов или тканей у эмбриона, не только конкретные стадии эмбриогенеза,но и наличие эмбриональных черт в целом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
