Автореферат (1145860), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Полученные данные указывают на его существенное падениеуже на 2-й день жизни мух во всех исследованных трансгенных линиях сэкспрессией как APP и его форм, так и в линиях с образованием Aβ (совместнаяэкспрессия АРР и ВАСЕ). Подобная картина сохранялась и на 30-й день для syt1,за исключением линий с экспрессией укороченных форм APPCT и APPNT.Интересно, что на 30-й день уровень мРНК n-syb снижался только в линиях сэкспрессией полноразмерного АРР (АРР и АРР-Sw).
Как было отмечено ранее,трансгенные линии Drosophila позволяют разделить эффекты АРР и A. Мыполагаем, что наблюдаемое снижение уровня мРНК syt1 и n-syb обусловленоэкспрессией именно гена АРР и независимо от секреции Аβ. Хотя нашиэксперименты были проведены на трансгенных организмах, в литературе13представлены данные о том, что дупликации гена АРР может приводить кразвитию БА [Rovelet-Lecrux et al., 2006].Можно предположить, что важную роль в изменении уровня экспрессиипресинаптических генов может играть С-концевой фрагмент белка APP – AICD –небольшой пептид размером в 6-kDa, отщепляющийся в результате действиягамма-секретазы.
Показано, что AICD может проникать в ядро, связываться сразличными внутриклеточными адапторными белками, влияя через них на многиеклеточные процессы, в частности генную экспрессию, синаптическуюпластичность и память [Kim et al., 2003; Muller et al., 2007; Cao, Sudhof, 2001; Gao,Pimplikar, 2001]. С другой стороны, не только фрагменты АРР, но и он сам можетучаствовать в регуляции транскрипции. Так гиперэкспрессия АРР в нейронахуменьшала уровень мРНК белков, участвующих в обороте холестерина (SREBP,HMGCR, cholesterol 24‐hydroxylase) [Pierrot et al., 2013].Таким образом, нарушения процессов транскрипции генов синаптическихбелков могут лежать в основе изменения синаптической плотности, наблюдаемойпри БА, и являются одним из ранних признаков заболевания.
Изменениеэкспрессии гена АРР или мутации в нем могут приводить к уменьшению уровнямРНК синаптических белков и вызывать синаптическую патологию при БА.2.2.1. Метилирование ДНК как один из факторов, регулирующих активностьгенов синаптических белков в трансгенных особях DrosophilaОдной из причин изменения транскрипционной активности генов можетбыть изменение статуса метилирования промоторной области исследуемых генов.Эпигенетическая регуляция активности генома путем метилирования остатковцитозина – широко распространенное в природе явление, наблюдаемое у многихпредставителей эукариот. Долгое время считалось, что у Drosophilaметилирование ДНК либо отсутствует полностью, либо не играет существеннойроли в регуляции активности генов.
В основном это объяснялось отсутствием уDrosophila гомологов канонических метилтрансфераз человека. Кроме того, небыло показано наличие 5-метилцитозина в геноме Drosophila [Kunert et al., 2003;Gowher et al., 2000]. Однако последние исследования показали, что геномDrosophila содержит ген MT-2, который кодирует белок, обладающийметилтрансферазной активностью [Kunert et al., 2003]. Более сложный анализДНК позволил также обнаружить метилированный цитозин в ДНК, полученныйна разных этапах развития Drosophila, в том числе и на стадии имаго, где онобнаруживается в концентрации 1 метилированный цитозин на 1 000 – 2 000неметилированных [Gowher et al., 2000].
Таким образом, несмотря на не стольмасштабный уровень метилирования генома Drosophila по сравнению смлекопитающими, данная эпигенетическая регуляция может влиять натранскрипционную активность генов.Мы предположили, что именно изменение статуса метилирования геномаDrosophila при гиперэкспрессии APP и образовании Аβ ответственно за угнетениетранскрипционной активности исследуемых генов.14Мы оценили изменение статуса метилирования промоторных областейисследуемых генов. Статус метилирования гена syt1 на 2-й и 30-й деньпредставлены в табл. 1.Таблица 1Статус метилирования гена syt1ГенотипКол-во дней, % метилированияelav (контроль)1–2 дня100 ± 330 дней100 ± 2elav;APPelav;APP-Swedishelav;APPΔCT119 ± 5*116 ± 2*109 ± 4118 ± 3*119 ± 5*118 ± 9elav;APPΔNT114 ± 3*106 ± 2elav;BACE/APP105 ± 3108 ± 3elav;BACE;APP-Sw110 ± 4101 ± 4* – статистически достоверное отличие p ≤ 0,05.Из таблицы 1 видно, что статус метилирования промоторной области генаsyt1 на 2-й день после вылупления имеет тенденцию к росту во всех исследуемыхлиниях со статистически значимыми изменениями в линиях с экспрессией APP,APP-Swedish и APPΔNT, что коррелирует с данными по экспрессии этого гена.Подобная тенденция сохраняется и на 30-й день жизни мух.Несмотря на полученный в эксперименте незначительный рост уровняметилирования промоторной области гена n-syb, мы не наблюдали статистическизначимых изменения ни на 2-й, ни на 30-й день.2.3.
Изучение влияния содержания взрослых особей Dr. melanogasterc экспрессией последовательности, кодирующей пептид Аβ42, на средес дрожжами-продуцентами красного пигмента на амилоидогенези нейродегенеративные процессы в мозге мухСогласно наиболее популярной сегодня «амилоидной гипотезе» [Hardy,Higgins, 1992], нарушение синаптических функций в мозге, лежащее в основепотери памяти при БА, является результатом действия растворимых олигомеровАβ [Ferreira, Klein, 2011].
Несмотря на описание других механизмов, возможноперекрывающихся с образованием Аβ, основные стратегии разработки терапии дляБА в последние годы были сконцентрированы на поиске соединений, снижающихуровень Аβ [Giacobini, Becker, 2007]. Следовательно, терапия при БА должнавосстанавливать в мозге гомеостаз Аβ, который может быть нарушен в результатеизменений в образовании и клиренсе Аβ [Hardy, Higgins, 1992; Hardy, 2002; Hardy,2006].Мы оценили влияние содержания взрослых особей Dr. melanogaster cэкспрессией последовательности, кодирующей пептид Аβ 42, на среде с дрожжамипродуцентами красного пигмента на амилоидогенез и нейродегенеративныепроцессы в мозге мух.15Известно, что мутации в генах ADE-1 и (или) ADE-2 приводят к накоплениюв цитоплазме клеток дрожжей Sac. cerevisiae 5’-аминоимидазолрибозида, которыйпосле полимеризации и присоединения некоторых аминокислот образует красныйпигмент, в результате колонии мутантных дрожжей приобретают характернуюкрасную окраску.
Было обнаружено, что дрожжи красного штамма имеютзначительно сниженный уровень общего амилоида по сравнению с «белыми»дрожжами. Интересно, что штамм дрожжей, изогенный красному штамму,несущий дополнительную мутацию в гене ADE6, блокирующую синтез аденинана ранней стадии и не образующий в результате этого красный пигмент, имелзначительно более высокий уровень общего амилоида. Это позволяет сделатьвывод об антиамилоидных свойствах красного пигмента.
Было также показано,что добавление красного пигмента к разрушенным клеткам «белого» штаммаснижало уровень общего амилоида, из чего можно сделать вывод обэффективности красного пигмента in vitro. В другом опыте антиамилоидныйэффект красного пигмента был показан на фибриллах инсулина. В определенныхусловиях мономеры инсулина способны агрегировать и образовывать фибриллы.Осветленный дрожжевой лизат, содержащий красный пигмент, добавляли кфибриллам инсулина. Эффект анализировали путем определения уровняфлуоресценции тиофлавина Т, способного связываться с амилоидизированнымибелками.
Было выявлено значительное снижение уровня флуоресценции в пробахс добавленным красным пигментом по сравнению с пробами, в которые былдобавлен лизат, полученный из изогенного «белого» штамма [Nevzglyadova et al.,2011, Михайлова и др., 2011]. Кроме того, добавление чистого экзогенногокрасного пигмента к трансформированным дрожжам, в которых происходитобразование Аβ, существенно снижало содержание Аβ в лизатах, что былопоказано как с помощью анализа уровня флуоресценции тиофлавина Т, так и спомощью вестерн-блоттинга [данные готовятся к публикации].Приведенные выше данные, а также тот факт, что дрожжи служатприродным кормом для плодовой мушки, стали основой эксперимента по оценкевлияния потребления штамма-продуцента красного пигмента дрозофилой наамилоидизацию.ТрансгенныеDr.
melanogasterсэкспрессиейпоследовательностичеловеческого Аβ42 в нервных клетках – широко используемая модель дляизучения патогенеза Аβ in vivo. Было показано, что экспрессия Аβ в нейронахмозга приводила к прогрессирующей с возрастом нейродегенерации, нарушениямлокомоторных функций и преждевременной гибели мух. Так как дрожжи служатприродным кормом для плодовой мушки, для проведения эксперимента былодостаточно содержать трансгенных мух на среде с «красным» и «белым»изогенным штаммом дрожжей. По истечении необходимого для опыта временисодержавшиеся на разных штаммах особи Drosophila сравнивались попроявлению перечисленных выше черт патогенеза.Было оценено влияние потребления красного штамма дрожжей насодержание Аβ в мозге имаго трансгенных особей Drosophila с экспрессиейпоследовательности, кодирующей Аβ42.16С помощью иммуногистохимии и конфокальной микроскопии былоподтверждено отложение Аβ42 в мозге трансгенных мух.
Пример опытапредставлен на рис. 8.Как видно из рисунка, Аβ42 детектировался только в особях Drosophila сэкспрессией последовательности, кодирующей Аβ42. В контрольной линии сигналотсутствовал.Рис. 8. Детекция отложения Аβ в мозге мух:А – elav;Аβ42 («белые» дрожжи); Б – elav;Аβ42 («красные» дрожжи);В – контроль elav («белые» дрожжи); Г – контроль elav («красные» дрожжи)Для количественной оценки содержания Аβ42 методом вестерн-блота былопроведено измерение его уровня в мозге мух, потреблявших в пищу как«красные», так и «белые», не продуцирующие красный пигмент дрожжи.Относительное содержание Аβ42 было нормировано на α-tubulin. Примерэксперимента приведен на рис.
9.Рис. 9. Пример вестернблота по определениюуровня Аβ42:1 – контроль elav(«красные» дрожжи),2 – контроль elav («белые»дрожжи),3 – elav;Аβ42 («красные»дрожжи),4 – elav;Аβ42 («белые»дрожжи)В мухах, потреблявших в пищу «красные» и «белые» дрожжи,относительное содержание растворимой фракции Аβ42 составило 0,095 ± 0,04 и0,31 ± 0,04 соответственно. Подобные результаты были получены и длянерастворимой фракции. В этом случае содержание нерастворимой фракции Аβ42при содержании мух на среде с «красными» дрожжами составило 0,16 ± 0,06, с«белыми» – 0,60 ± 0,13 (рис. 10).17Рис. 10. Относительный уровень Аβ42 в мозге мух, содержавшихся на «красных»и «белых» дрожжах: А – растворимая фракция Аβ42; Б – нерастворимая фракция Аβ42:1 – elav;Аβ42 («красные» дрожжи), 2 – elav;Аβ42 («белые» дрожжи)Чтобы удостовериться, что наблюдаемый нами эффект не являетсяследствием общего угнетения транскрипционной активности в результатепотребления пигментобразующих дрожжей и (или) негативной регуляциисистемы GAL4-UAS, мы провели схожий эксперимент на трансгенных особяхDrosophila с экспрессией гена белка GFP.
В эксперименте использовались мухи,полученные в результате скрещивания линии elav-GAL4 и линии UAS-GFP. Былопоказано, что уровень GFP в мозге 20-дневных мух, потреблявших в пищу«красные» дрожжи, не отличался от такового в мухах, развивавшихся на «белом»штамме (рис. 11). Относительное содержание GFP было нормировано на α-tubulin.Рис. 11. Уровень GFP в мозге трансгенных особей Drosophila в зависимостиот штамма дрожжей, на которых они развивались:А – относительное содержание GFP в мозге Drosophila; Б – пример вестерн-блота:1 – elav;GFP («красные» дрожжи), 2 – elav;GFP («белые» дрожжи)18Таким образом, мы показали достоверное снижение уровня Аβ42 в мозгемух, потреблявших в пищу дрожжи-продуценты красного пигмента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
