Автореферат (1145860), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Мухисодержались на стандартной дрожжевой среде при температуре 25 °С при 12часовом световом дне.В работе использованы следующие методы: световая микроскопия,конфокальная микроскопия, ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинг,приготовление препаратов целых голов и парафиновых срезов мозга Drosophila,иммуногистохимические методы, методы анализа когнитивного состояния мух.2. Результаты и обсуждение2.1. Аномалии развития Drosophila с гиперэкспрессей гена APPи с образованием АβИсследования полноразмерного APP показали его значимость вразнообразных процессах, в том числе и в развитии нейродегенерации. Например,было показано, что дупликация гена APP приводит к раннему развитию БА саутосомно-доминантным типом наследования и церебральной амилоиднойангиопатии [Rovelet-Lecrux et al., 2005].
Для более полного понимания функцийбелка APP мы экспрессировали ген APP человека и его мутантную форму APPSwedish, приводящую к семейной форме заболевания, в нервных клеткахDr. melanogaster. Кроме того, мы провели совместную экспрессию этих генов cгеном β-cекретазы человека BACE. Так как у Drosophila есть все необходимыекомпоненты, ответственные за активность γ-секретазы, совместная экспрессияAPP и BACE приводила к образованию Аβ и последующему его отложению.Мы обнаружили, что как экспрессия APP, так и образование Аβ приводили квысокой летальности организмов на стадии куколки (рис.
1).7Генотип исследуемых мухРис. 1. Выживаемость куколок в зависимости от генотипа (%):1 – elav, 2 – elav;BACE/APP-SW, 3 – elav;BACE/APP, 4 – elav;APP-SW, 5 – elav;APPЭкспрессия APP и APP-Sw в нервных клетках Drosophila как отдельно, так исовместно с BACE вызывала появление большого количества морфологическиханомалий у взрослых мух, которые проявлялись в виде меланизации и некрозатканей в области хоботка, патологических изменений самого хоботка,недоразвитых крыльев и раздутых абдоменов, заполненных гемолимфой, чтоговорит об активном воспалительном процессе (рис.
2, 3).Рис. 2. Морфологические аномалии у мух с гиперэкспрессией APP:А – гиперэкспрессия APP вызывает сильную деформацию и некроз хоботка,недоразвитие крыльев и раздутие абдомена; Б – мухи генотипа elavне обнаруживают морфологических аномалий.1 – крылья, 2 – абдомен, 3 – хоботок8Рис. 3. Деформация хоботкау мух с гиперэкспрессией APP:A – мухи генотипа elavне обнаруживают морфологических изменений хоботка;B – гиперэкспрессия APPвызывает сильную деформациюхоботка. 1 – основание хоботка,2 – верхняя губа,3 – нижнечелюстные щупики,4 – нижняя губа, 5 – лабеллумыс псевдотрахеямиУ мух с аномальной морфологией наблюдалось появление асимметрии встроении основания хоботка и его увеличение на 20–30 % по сравнению сконтролем.
Кроме того, в отличие от контрольной линии у исследуемых мухнаблюдалось также 20–30 %-ное утолщение верхней и нижней губы.Нижнечелюстные щупики также были заметно увеличены. При приблизительноодинаковой длине их ширина была на 30–50 % больше, чем у контрольной линии.Лабеллумы с псевдотрахеями были явно деформированы, что, по всей видимости,и приводило к невозможности потребления пищи.Мы исследовали частоту встречаемости морфозов у взрослых мух различныхгенотипов, выращенных как на стандартной дрожжевой среде, так и на болеепитательной среде, содержащей мелассу.
Среда с мелассой (далее в тексте м)была использована в эксперименте для оценки влияния калорийности на частотувозникновенияаномальныхморфологическихизменений.Результатыэксперимента представлены на рис. 4.Рис. 4. Частота встречаемости морфозов (%):1 – elav;APP,2 – elav;APP + м,3 – elav;APP-Sw,4 – elav;APP-Sw + м,5 – elav;BACE/APP,6 – elav;BACE/APP + м,7 – elav;BACE/APP-Sw,8 – elav;BACE/APP-Sw + мГенотип исследуемых мух9Как видно из приведенных выше графиков, частота проявления морфозовзависела от генотипа исследуемых мух.
Наиболее часто морфозы встречались влинии с гиперэкспрессией APP. Мы наблюдали снижение их количества как у мухс гиперэкспрессией APP-Sw, так и с гипреэкспрессией APP и BACE. А для линии содновременной гиперэкспрессией APP-Sw и BACE они были минимальны.Повышение питательности среды не оказало влияния на частоту возникновенияморфологических аномалий.Мы полагаем, что уменьшение количества морфозов при одновременнойэкспрессии APP и BACE объясняется падением уровня белка APP в нервныхклетках Drosophila. Падение же количества морфозов при экспрессии гена APP смутацией Swedish, возможно, объясняется ускорением процессинга APP.Необходимо отметить, что экспрессия только последовательности,кодирующей Аβ42 в мозге трансгенных особей Drosophila, не приводила кописанным выше дефектам развития.
Изучение трансгенных линий мух, несущихген другого крупного трансмембранного белка человека PSEN-1 или ген BACEтакже не выявило морфологических отклонений в развитии Drosophila.Полученные нами результаты показывают, что именно экспрессия APP в нервныхклетках Drosophila приводит к наблюдаемым патологическим дефектам развития,что указывает на участие APP в процессах развития и морфогенеза. Кроме того,меланизация тканей и наполнение абдомена гемолимфой указывает на то, чтогиперэкспрессия APP в мозге мух приводит к активации иммунного ответаорганизма.2.2.
Транскрипционные изменения генов syt1 и n-syb в мозге взрослыхмух при гиперэкспрессии APP и образовании АβРезультаты многочисленных исследований показывают, что самым раннимпроявлением БА является прогрессирующее падение синаптической плотности,сопровождаемоезначительнымснижениемсодержанияосновныхпресинаптических белков в мозге больных БА [Davidsson et al., 1998; Masliah andTerry, 1993]. Степень подобного падения коррелирует с тяжестью деменции исостоянием пациента.В то же время изменение уровня белков, принимающих непосредственноеучастие в синаптической передаче и формировании синапсов, может идтиразнонаправленно либо вообще не меняться.
Так, Sze с соавт. показали, чтоуровни белков синапсин-1 и SNAP не менялись ни у пациентов с выраженнойкогнитивной дисфункцией, ни у пациентов с начальной стадией когнитивныхизменений. В то же время уровень синаптотагмина значительно падал в областях,ответственных за формирование и консолидацию памяти – гиппокампе иэнторинальной области коры головного мозга, а падение уровня синаптобревинанаблюдалось независимо от исследуемого отдела [Sze et al., 2000].Анализ транскриптов на чипах Affymetrix HuFL, проведенный на аутоптатахмозга больных спорадической формой БА (средний возраст 82,7 года), показалснижение уровня транскриптов мРНК для основных классов синаптическихбелков [Yao et al., 2003].
Параллельно с этим исследованием было показанозначительное снижение уровня экспрессии гена syt [Mufson et al., 2002] и генов10VAMP1 и VAMP2, кодирующих две изоформы белка синаптобревина человека вмозге больных БА [Bossers et al., 2009]. Следует заметить, что в этихэкспериментах отсутствовали результаты для ранних стадий БА. Возможно,именно это обстоятельство не позволило отличить первичный эффект нарушениясинаптогенеза от других эффектов нейропатологического процесса.Drosophila содержит гомологи синаптических белков человека. Например, уDrosophila было выделено 7 различных изоформ белка syt, из которых только syt1обнаруживается в большом количестве в синапсах.
Также было выделено2 изоформы белка syb. Изоформа n-syb обнаруживается преимущественно внейронах.Ранее Sarantseva с соавт. показали существенное падение уровня белков syt1и n-syb при гиперэкспресии APP, АРР-Sw и при совместной их экспрессии с BACEв антеннальных долях и в грибовидном теле мозга Drosophila – структурах,отвечающих за формирование памяти и поведения, начиная с первых дней жизниживотных.
Подобные изменения плотности пресинаптических белков вызывалидостоверное ухудшение памяти и способности к обучению, что было показано спомощью теста Тулли и Квина [Sarantseva et al., 2009]. Оставалось, однако,неясным, какой механизм определяет снижение уровня синаптических белков вмозге трансгенных особей Drosophila.Мы оценили изменение транскрипции генов синаптических белков syt1 и nsyb как при образовании Aβ, так и при экспрессии полноразмерного APP иразличных его форм. Это позволило нам разделить патологический эффект,оказываемый Аβ от эффекта, оказываемого непосредственно APP или егоформами. Необходимо отметить, что в линиях с экспрессией генов, кодирующихукороченные формы APP, не происходит образования Aβ (из-за отсутствия бетасекретазы), но образуются С-концевые фрагменты APP.Мы экспрессировали APP, его мутантную форму APP-Swedish, приводящуюк семейной форме заболевания, его укороченные формы, а также ген BACE внервных клетках Dr.
melanogaster. Уровень мРНК генов syt1, n-syb анализировалиу 2- и 30-дневных мух следующих генотипов: elav (в качестве контроля),elav;APP, elav;APP-Swedish, elav;APPΔCT, elav;APPΔNT, elav;APP/BACE иelav;BACE;APP-Swedish. Полученные данные были нормированы относительноконтрольной линии с экспрессией гена elav.Мы наблюдали падение уровня мРНК гена syt1, нормированного насоответствующие показатели для референсных генов RP-49 и GAPDH2, на 2-й ина 30-й день (рис. 5).Мы также наблюдали падение уровня мРНК гена n-syb (рис. 6).11Рис. 5.
Относительный уровень мРНК гена syt1:1 – elav, 2 – elav;APP, 3 – elav;APP-Swedish, 4 – elav;APPΔCT, 5 – elav;APPΔNT,6 – elav;APP/BACE, 7 – elav;BACE;APP-Sw. * – статистически достоверноеотличие p ≤ 0,05; ** – статистически достоверное отличие p ≤ 0,001Рис. 6. Относительный уровень мРНК гена n-syb:1 – elav, 2 – elav;APP, 3 – elav;APP-Swedish, 4 – elav;APPΔCT, 5 – elav;APPΔNT,6 – elav;APP/BACE, 7 – elav;BACE;APP-Sw. * – статистически достоверноеотличие p ≤ 0,05; ** – статистически достоверное отличие p ≤ 0,00112Мы также исследовали изменение уровня мРНК гена psn Drosophila пригиперэкспрессии APP, его форм и образовании Aβ (рис. 7). Мы показалиотсутствие статистически значимого падения уровня м-РНК гена psn у 2-дневныхмух и увеличение уровня экспрессии у 30-дневных, что демонстрируетизбирательный негативный эффект APP и Aβ на экспрессию генов syt1 и n-syb.Рис. 7. Относительный уровень мРНК гена psn:1 – elav, 2 – elav;APP, 3 – elav;APP-Swedish, 4 – elav;APPΔCT, 5 – elav;APPΔNT,6 – elav;APP/BACE, 7 – elav;BACE;APP-Sw.
* – статистически достоверноеотличие p ≤ 0,05; ** – статистически достоверное отличие p ≤ 0,001Любопытно, что экспрессия другого гена трансмембранного белка человекапресенилина 1 (PSEN-1) и его мутантных форм в мозге мух не вызывала падениетранскрипционной активности исследуемых генов синаптических белков (данныене показаны).Таким образом, мы установили, что гиперэкспрессиия АРР изменяет уровеньмРНК syt1 и n-syb.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
