Диссертация (1145825), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Возможность образовывать циклическую форму островом патогенностиPAI-A и геномным островком PAI-B может быть проверена с помощью ПЦР.Также существует другой способ определения выхода мобильного элемента изхромосомы – постановка ПЦР с праймерами, комплементарными областям геномаза пределами острова, т.е. ПЦР-продукт будет образован в случае исключениямобильного генетического элемента из хромосомы. Праймеры 1413-7374, 14132425, 2524-7374 были использованы для определения циклической формы вштаммах 07у/08 и O9OR, содержащих PAI-A и PAI-B, а праймеры 1314-2524,2425-7473, 1314-7473 для обнаружения мобильных генетических элементов,вышедших из генома (рисунок 24).
ПЦР с праймерами 1413-7374, 1413-2425 и2524-7374 привело к образованию ПЦР-продуктов, т.е. генетические элементыPAI-A и PAI-B формируют как объединенную циклическую форму, так иотдельные циклические формы (рисунок 25). При проверке с помощью ПЦР82возможности выхода мобильных генетических элементов из генома, ПЦРпродукты были получены с праймерами 1314-2524, 2425-7473, 1314-7473, т.е.остров патогенности PAI-A и геномный островок PAI-B могут покидатьхромосомную ДНК как по отдельности, так и совместно.
Данный выводподтверждаеттообстоятельство,чтопрямыеповторы,фланкирующиеисследуемые генетические элементы идентичны.PAI-CPAI-BPAI-AКрасными прямоугольниками обозначены прямые повторы, черными стрелками –праймерыРисунок 24 – Локализация праймеров для определения циклической формымобильных генетических элементов в составе острова патогенности XII1231 – ПЦР со штаммом 07у/08 с праймерами 1413 – 73742– маркер молекулярного веса 100 – 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 н.п.3– отрицательный контрольРисунок 25 – Обнаружение циклической формы, образованной геномнымостровком и островом патогенности833.9 Сравнительный анализ острова патогенности, ассоциированного с геномsspB1, с островом патогенности, ассоциированным с геном sspB1aHerbert и соавторы полагали, что остров патогенности XII являетсягетерогенным в штаммах NEM316 и 2603V/R [51].В штамме NEM316локализован ген sspB1, а в штамме 2603V/R – ген sspB1a.
Однако в данномисследовании остров патогенности XII был разделен на три мобильныхгенетических элемента. Сравнение генетической организации PAI-A в штаммахNEM316 и 2603V/R выявило, что состав генов, ассоциированных с генами sspB1 иsspB1a, отличается. Поэтому остров патогенности, ассоциированный с геномsspB1a, был назван PAI-A1. В состав островов патогенности PAI-A и PAI-A1входят гомологичные гены, а именно: гены sspB1 и sspB1a, гены абортивнойинфекции и гены системы секреции IVC типа. Однако lac оперон, система токсинантитоксин были обнаружены только наPAI-A (рисунок 26).
На PAI-A1локализованы оперон резистентности к ртути и гены транспорта кадмия.Таким образом, можно предположить, что острова патогенности PAI-A иPAI-A1 являются независимыми мобильными генетическими элементами СГВ.Рисунок 26 – Сравнительный анализ генетической организации острововпатогенности, ассоциированных с генами sspB1 и sspB1aВ ряде штаммов СГВ из России остров патогенности, ассоциированный сгеном sspB1 (PAI-A), характеризовался гетерогенностью. В штамме 10/0884отсутствовали гены gbs1352 и gbs1364, в штаммах 09н/08, 09у/08, 08н/08, 08у/08,08з/08 – гены gbs1343 и gbs1364, в штаммах 05н/08, 05у/08 – гены gbs1343, sspB1,gbs1360, gbs1364, в штамме 506 – гены gbs1348, gbs1352, sspB1, gbs1360, gbs1364(рисунок 27).
В связи с тем, что в ходе анализа был охарактеризован другойостров патогенности, сходный по генетической организации состровомпатогенности PAI-A, вышеперечисленные штаммы были проанализированы наналичие гена sspB1a. В результате ПЦР ген sspB1a был обнаружен в штаммах 506,05н/08, 05у/08, 08н/08, 08у/08, 08з/08, 10/08. В штаммах 09н/08, 09у/08 в связи сотсутствием гена sspB1a локализован остров патогенности, гомологичный PAI-A,однако, имеющий другую организацию. В штаммах 08н/08, 08у/08, 08з/08, 10/08методом ПЦР выявлялся как ген sspB1, так и ген sspB1a.
В связи с этим былосделано предположение о том, что существует еще один ген, гомологичный какsspB1, так и sspB1a. Следовательно,возможно наличие другого островапатогенности, сходного с PAI-A и PAI-A1. В штаммах 506, 05н/08, 05у/08локализованы 2 вида острова патогенности PAI-A1. Для более точногоопределения организации островов патогенности в вышеупомянутых штаммах,необходимо секвенирование всего мобильного генетического элемента.85Рисунок 27 – Организация островов патогенности, гомологичных PAI-A и PAIA1, представленная по результатам ПЦР3.10 Анализ штаммов из Португалии и Анголы на наличие генов,ассоциированных с геном sspB1aВ ряде штаммов из Португалии и Анголы был обнаружен ген sspB1a.
Всвязи с этим коллекция из 44 штаммов СГВ из Португалии и 19 штаммов изАнголы была проанализирована на наличие генов gbs1348а и gbs1352а,локализованных на острове патогенностиPAI-A1, ассоциированном с геномsspB1a. Распространенность генов gbs1314, gbs1316, gbs1324, входящих в составгеномного островка PAI-В, также была определена среди штаммов даннойколлекции методом полимеразной цепной реакции. Ген gbs1311, обнаруженныйво всех штаммах, был использован в качестве положительного контроля ПЦР.Были подобраны праймеры на гены gbs1348а, gbs1352а штамма 2603V/R,гомологичные генам gbs1348 и gbs1352 штамма NEM316 (таблица 1).86Ген gbs1311 был обнаружен в геномах всех исследуемых штаммов, генgbs1314 – в геномах 30 штаммов из Португалии и 2 штаммов из Анголы, генgbs1316 – 35 из Португалии и 5 из Анголы, ген gbs1324 – 42 из Португалии и 13из Анголы (таблица 14).
У 9 штаммов были обнаружены только гены gbs1316 иgbs1324, а ген gbs1314 отсутствовал. У одного штамма присутствовали толькогены gbs1314 и gbs1324, а ген gbs1316 отсутствовал. У 14 штаммов былобнаружен только ген gbs1324. Таким образом, остров PAI-В был обнаружен у 42штаммов из Португалии и 13 штаммов из Анголы, что составляет 87%, нохарактеризовался высокой степенью гетерогенности.Ген gbs1348а был обнаружен у 4 штаммов из Португалии, а ген gbs1352а – 6из Португалии.
В таблице 14 также представлены данные о локализации генаsspB1a в штаммах СГВ из Португалии и Анголы. Гены gbs1348а, gbs1352а,sspB1a были обнаружены у 3 штаммов из Португалии, ген gbs1348а – у 1 штаммаиз Португалии, ген gbs1352а – у 3 штаммов из Португалии, а ген sspB1a – у 7штаммов из Португалии и 1 штамма из Анголы.
Присутствие гена sspB1aассоциировали с локализацией в геноме СГВ острова патогенности PAI-A1.В целом, результаты анализа показали, что ген gbs1314 был обнаружен у 69из 140 штаммов, ген gbs1316 – у 76 из 140 штаммов, ген gbs1324 – у 93 из 140штаммов, островок PAI-В – у 93 из 140 штаммов, ген sspB1a – у 57 из 171штамма. Таким образом, частота распространенности гена gbs1314 составила49%, гена gbs1316 – 54%, гена gbs1324 – 66%, острова PAI-В – 66%, гена gbs1348а– 6%, гена gbs1352а – 10%, остров PAI-A1 – 33%.87Таблица 14 – Результаты ПЦР с португальскими и ангольскими штаммами нагены, ассоциированные с sspB1agbs1314gbs1316gbs1324gbs1348agbs1352asspB1aСтранаgbs1311Число1Португалия+++++++1Португалия+++++--3Португалия++++-+-5Португалия++++--+19Португалия++++---1Португалия++-+---1Португалия+-++--+5Португалия+-++---1Португалия+--++++1Португалия+--+--+1Португалия+---+++4Португалия+--+---1Португалия+------2Ангола++++---1Ангола+-++--+2Ангола+-++---8Ангола+--+---6Ангола+------штаммов884 ОбсуждениеСтрептококки группы В являются причиной возникновения тяжелыхзаболеваний новорожденных и взрослых людей.
СГВ обладают различнымимобильными генетическими элементами, способствующими быстрой адаптации кновым условиям окружающей среды. Данная работа посвящена исследованиюострова патогенности XII стрептококков группы В.Первоначально нумерация островов патогенности у СГВ была введена дляштамма NEM316 [54]. Дальнейший анализ мобильных генетических элементов вгеномеСГВпозволилвыявитьналичиесходногоостроваотличающегося по организации. На острове патогенностинесколькоXII СГВ былолокализовано несколько генов патогенности, включая гены С5а пептидазы,ламинин-связывающего белка и адгезина sspB1, наличие которого в геномештаммов СГВ коррелирует с возникновением инфекций в урогенитальном тракте[1; 41; 54].
В отличие от первоначально охарактеризованного PAI XII в штаммахс другой организацией острова вместо гена sspB1 обнаруживался его аналог,обозначенный как sspB1а.В процессе анализа свойств гена sspB1 созданы конструкции для экспрессиии инактивации генаsspB1, которые могут быть использованы при созданиивакцины против стрептококков группы В и для определения вклада гена sspB1 вформирование вирулентных свойств СГВ соответственно.Для исследования состава и структурных особенностей генов СГВ,расположенных на острове патогенностиXII,был проведен компьютерныйанализ каждой из открытых рамок считывания с помощью программы BLAST.
Врезультате компьютерного анализа последовательностей в базе данных GenBankбыли сконструированы ДНК праймеры для проведения ПЦР на ДНК изколлекции штаммов, выделенных в России и ряде зарубежных стран.Распространенность острова патогенности XII составила 14% и 0% средиштаммов СГВ из России и зарубежных стран соответственно.89КоллекцииштаммовСГВизРоссии,США,Германиибылиохарактеризованы с использованием мультиплексной ПЦР на гены капсульногооперона [90]. При сопоставлении данных мультиплексного типирования срезультатами анализа распространенности острова патогенности XII былообнаружено, что выбранные в исследовании штаммы принадлежали разнымсеротипам, но не существует корреляции между наличием PAI XII и серотипомСГВ.С помощью точного критерия Фишера была проверена гипотеза о связи двухкачественных признаков: наличия острова патогенности и происхожденияштаммов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
