Диссертация (1145825), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Так какостальные гены присутствовали в геномах данных штаммов, то было сделанозаключение, что остров патогенности локализован в геномах этих штаммов.Однако у двух штаммов (05н/08, 05у/08) были обнаружены только гены gbs1348 иgbs1352, кодирующие белок Zn-finger и метилтрансферазу соответственно,поэтому в данных штаммах остров отсутствовал. У одного штамма (506)присутствовал только ген gbs1343, кодирующий zeta токсин. Поскольку ген zetaтоксина мог быть локализован на другом участке хромосомы или на плазмиде,логично допустить, что в штамме 506 отсутствует остров патогенности.Таким образом, остров патогенности XII был обнаружен в геномах 16 из 113штаммов из России, что составило 14%.
При этом он характеризовалсягетерогенностью.Для определения распространенности острова в различных регионах мирабылипроанализированыколлекцииштаммовизСША,Германии,Великобритании, Португалии и референс штаммы из Чешской республикипосредством ПЦР (таблица 4).В геномах всех штаммов из США, Германии, Великобритании, Португалии иЧешской республики был обнаружен только ген gbs1376, не относящийся кострову патогенности. В геномах 59 штаммов из зарубежных стран не удалосьобнаружить исследуемые гены, что свидетельствовало об отсутствии данногоострова патогенности в проанализированных штаммах (таблица 4).Таким образом, остров патогенности обнаружен только в геномах 16 из 113штаммов из России и не был обнаружен в геномах 59 штаммов из зарубежныхстран.58gbs1348gbs1352sspB1gbs1360gbs1364gbs137695Россия------+2Россия-++---+1Россия+-----+10Россия+++++++5Россия-++++-+1Россия++-++-+12США------+9Чешская республика------+16Германия------+10Великобритания------+12Португалия------+Странаgbs1343ЧислоштаммовТаблица 4 – Анализ штаммов стрептококков группы В методом ПЦРШтаммы из России, в геномах которых были обнаружены гены островапатогенности, принадлежали к разным серотипам, то есть сопоставление данныхмультиплексного типирования с результатами анализа на локализацию геновострова показало, что не существует корреляции между наличием островапатогенности и серотипом СГВ (таблица 5).59Таблица 5 – Серотипы штаммов из России, содержащих остров патогенностиСеротип СГВ Количество штаммов из Доля серотипа среди штаммов сРоссииостровом, %Ia425II425III318,75IV425NT16,253.3 Статистическая обработка результатов ПЦР со штаммами на геныострова патогенности, ассоциированного с геном sspB1В связи с тем, что выборка штаммов из зарубежных стран меньше, быласоставлена таблица сопряженности для проверки гипотезы о связи двухкачественных признаков: наличие острова патогенности и происхожденияштаммов.
Для этого был использован двусторонний вариант точного критерияФишера [2].Таблица 6 – Сравнение штаммов из России и США с помощью двустороннегокритерия ФишераШтаммы из РоссииШтаммы из СШАНаличиеострова Отсутствиепатогенностипатогенности1698012островаВероятность была подсчитана с помощью программы Statistica ver.10 и равнаp=0,3606, т.е. p>0,05 (таблица 6). Штаммы из России и из США не сопоставимыпо представленности острова патогенности.
При сравнении штаммов из другихстран вероятность также оказалась больше 0,05 (таблицы 7, 8, 9, 10).60Таблица 7 – Сравнение штаммов из России и Великобритании с помощьюдвустороннего критерия ФишераШтаммы из РоссииШтаммы из Великобританииp=0,3576.Наличиеострова Отсутствиепатогенностипатогенности1698010островаТаблица 8 – Сравнение штаммов из России и Германии с помощью двустороннегокритерия ФишераШтаммы из РоссииШтаммы из Германииp=0,2171.Наличиеострова Отсутствиепатогенностипатогенности1698016островаТаблица 9 – Сравнение штаммов из России и Чешской республики с помощьюдвустороннего критерия ФишераШтаммы из РоссииШтаммыизреспубликиp=0,6037.Наличиеострова Отсутствиепатогенностипатогенности1698Чешской 09островаТаблица 10 – Сравнение штаммов из России и Португалии с помощьюдвустороннего критерия ФишераШтаммы из РоссииШтаммы из Португалииp=0,3606.Наличиеострова Отсутствиепатогенностипатогенности1698012островаТаким образом, штаммы из России и штаммы из зарубежных странневозможно сравнивать по наличию острова патогенности.С помощью таблицы сопряженности сравнивали штаммы из России со всемиштаммами из зарубежных стран по наличию острова (таблица 11).61Таблица 11 – Сравнение штаммов из России и зарубежных стран с помощьюдвустороннего критерия ФишераНаличиеострова ОтсутствиепатогенностипатогенностиШтаммы из России1698Зарубежные штаммы059Вероятность равна p=0.0014, т.е.
p<0,05.островаВероятность оказалась меньше 0,05, то есть различия – достоверны.Таким образом, частота встречаемости острова патогенности среди геномовштаммов из зарубежных стран ниже, чем частота встречаемости в геномахштаммов из России.3.4 Масс-спектрометрический анализ штаммов стрептококков группы ВМасс-спектрометрияиспользоваласьдлясравненияштаммовСГВ,содержащих и не содержащих острова патогенности XII.
Спектры 9 штаммов состровом сравнивали со спектрами 10 штаммов без острова. В штамме С-10 былобнаружен пик размером 3010 Да, но данный пик отсутствовал как в другихштаммах с островом, так и в штаммах без острова (рисунок 9). Поэтомуобнаружение данного пика не коррелировало с наличием острова патогенности.Таким образом, метод масс-спектрометрии в диапазоне молекулярных весов от2000 до 18000 не позволяет дифференцировать штаммы СГВ с островомпатогенности и без острова патогенности.62Рисунок 9 – Результаты масс-спектрометрии со штаммами СГВ633.5 Создание рекомбинантных конструкций для экспрессии и инактивациигена sspB1При создании конструкции для экспрессии гена sspB1 был выбранэкспрессионный вектор pQE. Учитывая расположение сайтов рестрикции намолекуле вектора, были сконструированы праймеры ss_bam_L и ss_hind_R на генsspB1 с сайтами рестрикции ферментов HindIII и BamHI (таблица 1). В результатерестрикции амплификата, размер вставки уменьшился на 56 н.п.
за счѐт ещѐодного сайта рестрикции фермента HindIII, локализованного на одном из концовПЦР-продукта. Был осуществлен подбор рамки считывания с помощьюкомпьютерной программы Translate. Клонирование фрагмента гена sspB1проводили в вектор pQE-32. В качестве реципиента использовали штамм E. coliM15. Клетки E.
coli после трансформации высевали на агар, содержащий 100мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина. Среди полученных трансформантов11 клонов проверили на наличие вставки в плазмидах методом гельэлектрофореза. Подвижность клонов 2, 4, 13, 15, 16, 17, 18 была медленнее посравнению с подвижностью исходного вектора, что позволило предположитьналичие вставки (рисунок 10).Наличие соответствующей вставки в векторе проверяли с помощьюрестрикции и секвенирования плазмиды с праймерами на вектор pQE(GCGGATAACAATTTCACACAGAA – pQE1, CCGTAATATCCAGCTGAACG –pQE2). В результате рестрикции был вырезан фрагмент около 900 н.п., которыйсоответствовал ожидаемому размеру вставки.Секвенирование подтвердило наличие встройки последовательности генаsspB1 в векторе pQE-32 (рисунок 11).642, 3, 4, 5, 9, 10, 13, 15, 16, 17, 18 – номера клонов19 – исходный вектор pQE-3220 – маркер молекулярного веса 100-1000, 1200, 1500, 2000, 3000 н.п.Рисунок 10 – Электрофореграмма плазмидных ДНК, выделенных изрекомбинантных клонов pQE-32 с фрагментом гена sspB1Рисунок 11 – Результаты секвенирования конструкции для экспрессии гена sspB1При создании конструкции для инактивации гена был выбран векторp7ErmB, содержащий ген устойчивости к эритромицину.
Была поставлена ПЦР наген sspB1 с праймерами ss_bam_L и ss_hind_R, которые были использованы присоздании конструкции для экспрессии гена sspB1. Вектор p7ErmB был выделен спомощью набора для выделения плазмидной ДНК Miniprep. Амплификат и векторрестрицировали ферментами BamHI и HindIII. Рестрицированный амплификат65был очищен набором PCRCleanUp. Лигазной смесью трансформировали штаммDH5α E.coli.Для проверки правильности клонирования были отобраны 10 клонов,которые были пересеяны на твердую агаризованную и жидкую среды сдобавлением эритромицина (700 мкг/мл).
Из 10 клонов были выделены плазмиды.Наличие вставки в них оценивали по подвижности в агарозном геле по сравнениюс вектором p7ErmB. Плазмиды из двух клонов двигались в агарозном гелемедленнее, чем вектор p7ErmB, следовательно, можно было предположитьналичие в них вставки (рисунок 12). Для подтверждения наличия вставкипроводили рестрикцию выделенных плазмид ферментами HindIII и BamHI. Врезультате рестрикции данных 2 клонов наблюдали 2 полосы: одна полосасоответствовала вектору, вторая – вставке размером около 900 н.п (рисунок 13).Таким образом, была получена плазмида 3_sspB, содержащая участок гена sspB1,для инактивации по односайтовой рекомбинации.1-10 – номера клонов11 – исходный вектор p7ErmB12 – маркер молекулярного веса 100-1000, 1200, 1500, 2000, 3000 н.п.Рисунок 12 – Электрофореграмма плазмидных ДНК, выделенных изрекомбинантных клонов p7ErmB с фрагментом гена sspB1661 – рестрицированный клон 32 – рестрицированный клон 63 – рестрицированный вектор p7ErmB4 – клон 35 – клон 66 – исходный вектор p7ErmB7 – маркер молекулярного веса 100-1000, 1200, 1500, 2000, 3000 н.п.Рисунок 13 – Рестрикционный анализ клонов 3 и 6Создание конструкции для инактивации с помощью двойного кроссинговерапроисходило следующим образом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
