Диссертация (1145825), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Изолят ILRI005 содержит 6 предполагаемых геномных островов, аILRI112 – 7 геномных островов [55].Как уже было упомянуто ранее, пили стрептококков также кодируютсягенами, расположенными на островах патогенности PI. У СГВ обнаружено тритипа островов PI: PI-1, PI-2a и PI-2b [38; 75]. В штамме 09mas018883 СГВобнаружено 2 типа PI: PI-1 и PI-2 [53].
PI-2a кодирует три структурныхсубъединицы, обозначенные как PilA, PilB и PilC, для сборки которыхнеобходимы две сортазы класса С, а также регулятор, ассоциированный с пилями(рисунок 4). PilB – это основной белок; PilA – адгезин, локализованный на концепили; а PilC – якорь пили, обнаруженный вблизи бактериальной поверхности.Структура PI-1 аналогична PI-2a, а в состав PI-2b вместо гена регулятора входитген сигнального шаперона (рисунок 4).На рисунке красным цветом изображен ген PilB, зеленым – PilA и PilC, голубым –сортазы, желтым – регулятор, фиолетовым – сигнальный шаперон, подобныйпептидазеРисунок 4 – Генетическая организация островов патогенности, на которыхкодируются пили разных типов [38]У СГВ был обнаружен остров патогенности размером 8992 н.п., на которомлокализованы гены bac, кодирующий IgA связывающий белок и геныдвухкомпонентнойрегуляторнойсистемы.Вданнуюдвухкомпонентнуюрегуляторную систему входят сенсорная гистидинкиназа и ДНК-связывающий32белок [3].
Данный остров патогенности присутствует не у всех штаммов СГВ иобладает следующими свойствами:1) Гены двухкомпонентной регуляторной системы и bac локализованы рядом другс другом;2) Присутствуют инсерционная последовательность IS1381 и гомолог IS1167Streptococcuspneumoniae,гомологгена,кодирующеготранспозазуStreptococcus pyogenes;3) G+C состав острова отличается от G+C состава, характерного для СГВ [20].1.4 Заключение по обзору литературыДлительное время стрептококки группы В рассматривались исключительнокак возбудители мастита у коров, однако более углубленное изучение данногопатогена выявило его способность вызывать тяжелые инфекционные заболеваниячеловека, причем как у новорожденных, так и взрослых людей.
Помимозаболеваний людей, СГВ являются причиной инфекций различных животных,включая крупный рогатый скот, собак, кошек, слонов, кур, верблюдов, лошадей,обезьян, нутрий, хомяков, мышей, морских млекопитающих, крокодилов,лягушек, рыб, что приводит к экономическим потерям в сельском хозяйстве и врыбном промысле. СГВ экспрессируют широкий набор генов, кодирующихфакторыпатогенности,благодарякоторымбактерияпроявляетсвоиболезнетворные свойства. Гены многих факторов патогенности локализованы намобильных генетических элементах, которые обуславливают высокую степеньразнообразия организации стрептококкового генома.Бактерии склонны к элиминации генов, приобретенных с помощьюгоризонтального переноса, при отсутствии селективного давления.
Во избежаниеэлиминации генов, приобретенных посредством горизонтального переноса,некоторые мобильные генетические элементы содержат системы, которыеспособствуют их стабильному существованию в микробной популяции – системытоксин-антитоксин.33К мобильным генетическим элементам относятся плазмиды, бактериофаги,интегроны, транспозоны, а также более крупные генетические образования – такназываемые «острова патогенности». Гены, локализованные на островахпатогенности,часторассматриваютсякакмолекулярныемаркерыдлядиагностирования бактериальных патогенов.
Острова патогенности играютважную роль в патогенезе инфекционных заболеваний бактериальной природы,способствуют быстрой адаптации к новым условиям окружающей среды иповышают вирулентный фенотип бактерии.У СГВ обнаружено до 15 островов патогенности, различающихся поорганизации, структурным особенностям и размерам. Однако в большинствеслучаев области генома, обозначаемые в качестве островов патогенности,выявляются исключительно посредством биоинформационного анализа бездетального анализа их структуры и находящихся на островах генов.
Считается,что острова патогенности вносят вклад в быстрые эволюционные изменениябактерий, однако данные элементы широко представленные у СГВ практическине изучены. По данным литературы известно, что остров патогенности XIIначинается с гена gbs1296, а заканчивается геном gbs1373. Ген sspB1 локализованна острове патогенности XII и его обнаружение коррелирует с более частымвозникновением инфекций урогенитального тракта. В связи с ассоциацией генаsspB1 с инфекциями в мочеполовом тракте, было сделано предположение, что идругие гены на острове патогенностиXII, могут участвовать в развитииинфекции. Так гены scpB и lmb, кодирующие известные факторы патогенностиС5а-пептидазуиламинин-связывающийбелоксоответственно,такжерасположены на острове патогенности XII [51].
По данным других авторов онилокализованы на сложном транспозоне [47; 69].Часть генов островапатогенности XII, локализованных в штамме 2603V/R, имеют высокую степеньгомологии с генами острова патогенности 89K Streptococcus suis [17]. Tettelin исоавторы полагают, что гены sag1247-sag1299 штамма 2603V/R расположены наконъюгативном транспозоне [33]. Однако эти же гены входят в состав островапатогенности XII, согласно Herbert и соавторам [51]. По данным Brochet и34соавторов в штаммах NEM316 и 2603V/R локализованы 2 разных интегративныхконъюгативных элемента, которые имеют как сходства, так и отличия [77]. У генаsspB1 существует гомолог sspB1а, также локализованный на мобильномгенетическом элементе. В связи с противоречивыми литературными данными,необходимосравнитьорганизациюсодержащих гены sspB1 и sspB1а.мобильныхгенетическихэлементов,Их распространенность среди штаммовстрептококков группы В, циркулирующих в России, практически неизвестна.Для того чтобы объяснить существующие противоречия в научной литературеследовало определить организацию различных вариантов острова патогенностиXII и его распространенность, что позволило бы создать новые генетическиемаркеры для выявления наиболее вирулентных штаммов стрептококков группы В.Все вышеперечисленное определило цели и задачи данного исследования.352 Материалы и методы2.1 Материалы исследования2.1.1 Характеристика используемых материаловЖидкая питательная среда – Todd Hewitt Broth (THB) – Pronadisa, ИспанияTris – Amresco, СШАEDTA – Хеликон, РоссияNaCl – Вектон, Россия, «хч», ГОСТ 4233-77Лизоцим – Sigma-aldrich, СШАДодецилсульфат натрия – SDS – Вектон, ГерманияФенол – Вектон, Россия, «ЧДА», ГОСТ 23519-93Хлороформ – Вектон, Россия, ГОСТ 20015-88Протеиназа – Sigma-aldrich, СШАНуклеотиды – dCTP, dTTP, dGTP, dATP – Fermentas, ЛитваПраймеры – Синтол, РоссияПраймеры – Бигль, РоссияTaq-полимераза Dream – Fermentas, ЛитваБуфер 10х DreamTaq – Fermentas, ЛитваМинеральное масло – ICN, СШААгароза – Amresco, СШАКислота уксусная – Вектон, РоссияБромистый этидий – Amresco, СШАИзопропиловый спирт – Вектон, Россия, ГОСТ 9805-84Рестриктаза HindIII – Thermo scientific, ЛитваРестриктаза BamHI – Thermo scientific, ЛитваАгар бактериологический – Хеликон, РоссияГлицерин – Вектон, Россия36Глицин – Вектон, РоссияДрожжевой экстракт – Хеликон, РоссияLB бульон – Amresco, СШАБромфеноловый синий – «Химический завод» им.
Войкова, РоссияМаркер молекулярного веса GeneRuler – Fermentas, ЛитваЛигаза T4 – Promega, СШАХлорид кальция – Sigma-aldrich, СШААмпициллин – Синтез, РоссияКанамицин – Синтез, РоссияЭритромицин – Sigma-aldrich, СШАDTCS, смесь для постановки секвенирующей ПЦР – Beckman coulter, СШАГликоген – Beckman coulter, СШААцетат натрия – Amresco, СШАSample loading solution (SLS) – Beckman coulter, СШАIPTG – Медиген, РоссияXgal – Research products International corp, СШАНабор «ДНК-экспресс» – Литех, РоссияНабор для выделения плазмидной ДНК Mini prep – Qiagen, ГерманияНабор для очистки ДНК из геля Gel extraction – Qiagen, ГерманияНабор для очистки ПЦР продукта PCR clean up – Qiagen, Германия2.1.2 ОборудованиеМикроцентрифуга – Eppendorf, ГерманияКамера для горизонтального электрофореза – Биорад, СШАИсточник питания Эльф-8 – ДНК Технология, РоссияpH – метр – Аквилон, РоссияАмплификатор – Терцик, РоссияАмплификатор С1000 – Биорад, СШАТрансиллюминатор VersaDoc Imaging System – Биорад, США37Термостат ТС –80-М2 – СССРТермостат Термит – ДНК Технология, РоссияЦентрифуга с охлаждением Allegra – Beckman coulter, СШАЦентрифуга 5417R – eppendorf, ГерманияСеквенатор GEXP – Beckman coulter, СШАВакуумно-сушильный шкаф – ULAB, КитайМасс-спектрометр Maldi tof ultraflextreme – Bruker, ГерманияСтандартная мишень из нержавеющей стали – Bruker, Германия2.1.3 Объекты исследованияШтаммы стрептококков группы В:1) O9OR – музейный штамм серотипа Ia отдела молекулярной микробиологииФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН;2) 113 штаммов из Санкт-Петербурга, Россия (112 штаммов из ФГБУ "НИИАГ им.Д.О.
Отта" СЗО РАМН, 1 штамм в Северо-Западном государственноммедицинском университете имени И. И. Мечникова);3) 12 штаммов из США;4) 16 штаммов из Германии;5) 56 штаммов из Португалии;6) 9 референс штаммов из Чешской республики;7) 19 штаммов из Анголы.ДНК из 10 выделенных от носителей штаммов из Великобритании былавыделена с помощью MagNA Pure Compact сотрудниками центра по защитездоровья (Health Protection Agency) в Лондоне.Штаммы Escherichia coli (E.
coli):1) DH5α;2) JM109;3) M15.38Штаммы из Германии, Португалии, Анголы относились к двум группам:инвазивные (45 штаммов) и выделенные от носителей (46 штаммов).В исследовании использовались следующие плазмидные векторы: p7ErmB,pQE-32, pGEMTEasy.2.2 Методы исследования2.2.1 Компьютерный анализКомпьютерный анализ проводился с помощью базы данных National Centreof Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и компьютерныхпрограммBLAST,ClustalW2(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov,http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2).
Праймеры создавались с помощьюкомпьютерной программы Primer 3.0. G+C состав генов определяли с помощьюпрограммыпрограммыFastPCR.StatisticaСтатистическийver.10.анализПриосуществлялсяпредставленииспомощьюнуклеотиднойпоследовательности в виде вторичной структуры использовалась компьютернаяпрограмма The mfold Web Server (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNAFolding-Form). Филогенетический анализ осуществлялся с помощью программыMEGA 6 методом Maximum Parsimony.2.2.2 Выделение геномной ДНК фенол-хлороформным методомИзолированную колонию СГВ посеяли с агаризованной среды в 10 млбульона THB.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
