Диссертация (1145733), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Вместе с тем метод ДГГЭимеет также определенные ограничения. Так, с его помощью достоверно разделяются толькогеныизсравнительномалочисленныхсообществ,содержащихнесколькодесятковпредставителей (Нетрусов, 2004). Кроме того, для эффективного разделения н.п. необходимоиспользовать относительно небольшие фрагменты ДНК в 300 - 400 по (Ovreas, 2000), но не более500 по (Брюханов, 2012). Тем самым, данный метод затрудняет получение надежнойфилогенетической информации и однозначной таксономической идентификации филотиповмикробных сообществ (Nocker et al., 2007; Schiaffino et al., 2009).Ещё одним популярным методом, применяемым в изучении микробного разнообразия вантарктических водных экосистемах, является метод FISH.
Он позволяет идентифицироватьразличные филогенетические группы (зонды, как и «универсальные» праймеры, не “покрывают”всего разнообразия) непосредственно в природном образце без применения метода ПЦР, приусловии достаточности биомассы. К тому же FISH способен оценить число метаболическиактивных клеток, что невозможно осуществить при использовании методов ДГГЭ имолекулярного клонирования. В тоже время, для того чтобы определить количествожизнеспособных клеток, образцы необходимо фиксировать сразу, либо хранить оченьнепродолжительное время в определенных условиях (Брюханов, 2012). Все это существенноограничивает применение этого метода в условиях, не соответствующих стандартам чистоты,антарктических станций.Благодаря серьезному усовершенствованию методов секвенирования ДНК в последнее времяк изучению бактериального разнообразия применяются метагеномные подходы (Ng et al., 2010;Lauro, 2011; Yau & Cavicchioli, 2011; Vick-Majors et al., 2014).
С появлением этих методовпоявилась возможность более глубокого анализа природного биоразнообразия, а также намноголучшего понимания метаболического и биогеохимического потенциала изучаемых сообществ,тем самым, сократив разрыв между фенотипом и функцией (Riesenfeld, 2004; Nocker et al., 2007).Метагеномный анализ позволил расширить границу наших знаний о разнообразиимикроорганизмов, но, вместе с тем, привнес новые проблемы в виде огромного массивавходящих данных (миллионы и миллиарды последовательностей), которые трудны в обработкеи интерпретации, требующих применение программ, отличающихся от используемых при работес несколькими десятками последовательностями (метод клонирования).17Важно отметить, что в абсолютном большинстве работ, посвященных изучению микробногоразнообразия, вне зависимости от применяемого метода, для выявления представителей данныхсообществ используется только одна область гена 16S рРНК.Таким образом, несмотря на то, что в последнее время, как было сказано выше, дляопределения микробного разнообразия в различных озерах все чаще применяются методпиросеквенирование и метагеномный анализ (Parfenova et al., 2013; Lauro et al., 2011), методмолекулярного клонирования с последующим секвенированием генов 16S рРНК по Сэнджеру досих пор актуален (Zhang et al., 2013; Kojima et al., 2014) и удобен, в особенности при работе собразцами из экониш с небольшим микробным разнообразием, например пресноводныеантарктические озера (Villaescusa et al., 2013; Michaud et al., 2012).
Его информативность в планевидоидентификации микроорганизмов безусловно превышает таковую, полученную, например,методами пиросеквенирования ампликонов.1.5 Физико-химические факторы, влияющие на бактериальное разнообразие вповерхностных пресноводных озерахПервыми к пониманию истинной роли бактерий в глобальных биогеохимических процессахпришли во второй половине XIX века основатели микробной экологии и всемирно известныеученые Луи Пастер и С.Н.
Виноградский (Пиневич, 2007).Об огромной роли бактерий в пресноводных экосистемах впервые было заявлено в 1940-х гг.,когда Линдеман поставил “микробный бульон” (microbial ooze) в центр диаграммы,описывающей трофические связи в озере Сидар-Крик (Newton, 2011). С момента установлениятой критической роли, которую играют бактерии в мобилизации и трансформации питательныхвеществ в пресноводных трофических цепях, стало ясно, что водные бактерии участвуют вциклах основных биологически активных элементов в этих экосистемах (Newton, 2011).Влияние изменений таких абиогенных факторов как температура воздуха, скорость ветра искорость аккумуляции снега на озерные экосистемы Антарктиды имеет сложный характер изависит также от геоморфологии озера, площади его водосбора, а также от лимнологическихсвойств (Verleyen, 2012). Изменения физических и химических характеристик озер влияет наструктуру их сообществ, а также на биологические и биогеохимические процессы в этихводоемах, которые являются некими “горячими точками” биоразнообразия и микробнойпродуктивности в этой “холодной пустыне” (Laybourn-Parry & Pearce, 2007).В большинстве пресноводных сред бактериопланктон обитает в субоптимальных условияхпри низких температурах и с низким уровнем питательных элементов, ограничивающих ихобилие и продуктивность (Elser et al., 1995).
Бактериопланктон в антарктических озерах не18является исключением, в особенности из-за низкой или даже несущественной продуктивностифитопланктона, связанной, в свою очередь, с постоянным недостатком света (Delille, 2004). Врезультате нехватки свободного питательного субстрата бактериальные сообщества вероятноспособны переходить к стадии покоя и к инактивации.В настоящее время принято считать, что природные сообщества бактерий различных водныхобъектов содержат клетки, значительно различающиеся по метаболическому состоянию,находясь в диапазоне от ‘активных’до ‘покоящихся’ (Gasol & del Giorgio, 2000; Schumann et al.,2003). Исследования показали, что только часть клеток бактериопланктона находятся в активномсостоянии (Smith & del Giorgio, 2003).
Физиологическое состояние бактериопланктона вантарктических озерах в значительной степени не изучено, хотя некоторые исследованияпоказывают (на примере пресноводных озер Кривое и Дружба из оазиса Вестфолль), чтобактериальная продукция может осуществляться весь год, нередко с высокой скоростью даже взимний период (Laybourn-Parry et al., 2004; Säwström, 2008).1.5.1 Влияние низкой температурыРезультаты, полученные за последние годы, в области изучения микробной экологиикриосферы Земли показали, что даже в наиболее холодных эконишах присутствует большоеразнообразие жизнеспособных и метаболически активных популяций бактерий, представленныхосновными филогенетическими группами (Margesin, 2011).
Несмотря на различные факторы,воздействующие на бактериальные клетки, ключевой особенностью всех адаптированных кхолоду микроорганизмов является успешное преодоление негативных последствий низкихтемператур путем образования ряда структурных и физиологических приспособлений (Margesin,2011). Ещё Карри (1990) предположил, что связь между количеством бактериопланктона иконцентрацией хлорофилла a намного менее однозначна, чем думали ранее.
По его мнению,такие нетрофические факторы как температура намного более ответственны за различия вбактериальном обилии (Currie, 1990). Например, пик концентрации бактериопланктона в озереКривое (Оазис Вестфолль, Восточная Антарктида) приходился на время повышениятемпературы воды в весенний период (Laybourn-Parry et al., 1992).Известно, что основными последствиями действия гипотермии на бактериальную клеткуявляется снижение текучести мембран и стабилизация вторичных структур РНК и ДНК, что всвою очередь сказывается на процессах трансляции, транскрипции и репликации (Graumann,1996).
Предполагается, что в роли клеточных сенсоров выступают цитоплазматическаямембрана, нуклеиновые кислоты и рибосомы, изменения которых являются ключевым моментомв процессе адаптации к охлаждению (Ермилова, 2012). Кроме того, психрофильные бактерии19способны продуцировать и поглощать различные криопротекторные вещества, например,внеклеточные полисахариды и хорошо растворимые соединения (полиамины, сахара и др.), атакже регулировать специфические метаболические пути.
Продуцируемые психрофильнымибактериями так называемые “cold active” ферменты, способны на порядок быть более активнымипри низких температурах, чем их мезофильные гомологи (Bowman, 2008).Известно, что бактерии, живущие в холодных водных средах (напр. антарктический морскойлед), продуцируют большое количество экзополимерных веществ. Эти соединения образуют наповерхности клеток матрицу, которая является не только ловушкой для питательных веществ, нои защищает клетку от агрессивной внешней среды (Nichols, 2005).Исследование антифризных белков показало, что эти молекулы могут эффективновзаимодействовать с поверхностью образующихся внутриклеточно кристаллов льда, ингибируярост последних, что предотвращает возможные повреждения клеточных структур и способствуетвыживанию организмов при отрицательной температуре (Gilbert, 2004, Ермилова, 2012).Исследования бактериального разнообразия соленых антарктических озер показали наличиеантифризных белков у бактерий, относящихся преимущественно к классу γ - Proteobacteria.
Втоже время, среди бактериальных сообществ пресноводных антарктических озер, подобныебелки выявлены не были (Gilbert, 2004). Авторы объясняют это тем, что соленые водныеэкосистемы подвержены более резкому колебанию температур, например, в гиперсоленом озереГлубокое (Оазис Вестфолль) летние температуры достигают +11 °С, тогда как зимниеопускаются до -18 °С (Kerry et al., 1977).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
