Диссертация (1145733), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Стоит отметить, что, как и ранее, интересученых к пресноводным системам территориально привязан, в основном, к районуантарктического полуострова и окружающим его островам в Западной Антарктиде (Goldman etal., 1972; Heywood, 1978). Что очевидно связано с наличием большого числа антарктическихстанций в данном районе и, как следствие, с высокой доступностью озер, по сравнению сводоемами Восточной Антарктиды.
Кроме того, в связи с экстремальными условиями для жизнии работы, изучение антарктических озер проводится в основном в летний период времени, темсамым, информация о функционировании таких объектов в остальные времена года весьмаограничена.Важная особенность как соленых, так и пресных антарктических озер в том, что эти водныеобъекты в большинстве своем не подвержены антропогенному воздействию, тем самым, онисохраняют в нетронутом виде свои биотопы. Такие уникальные системы очень чувствительны клюбым внешним изменениям, что делает их не только важнейшим индикатором окружающейсреды, но и позволяет изучать механизмы воздействия различных экологических факторов на эти“островки” жизни (Quayle et al., 2002).Таким образом, уникальная комбинация таких экстремальных условий среды создает иподдерживает в антарктических озерах простые укороченные пищевые цепочки с отсутствиеммегафауны.
В такой ситуации основную экосистемную роль в озерах выполняет так называемаямикробиальная “петля”, ключевой компонент которой представлен бактериями и простейшимиэукариотами (Protozoa), а также планктонными водорослями и мелкими ракообразными(Laybourn-Parry, 2002, 2009). Тем не менее, в случае с прокариотными сообществами,обитающими в антарктических озерах, информация ограничивается только немногимирегионами этого континента (Michaud, 2012).1.4 Методы и подходы, применяемые для изучения бактериального разнообразия вантарктических пресноводных озерахПервым на существование микробной жизни на антарктическом континенте указал врачбактериолог Эрик Экелёф - участник шведской антарктической экспедиции 1901-1903 гг (Ekelöf,1908a).
Это сообщение затем неоднократно подтверждалось различными авторами (Pirie, 1912;14Gazert, 1912), описавшими бактерий, выявленных из водных и почвенных образцов. Немногопозже гетеротрофных бактерий в Антарктиде, способных к активному делению и росту принизких температурах, описал Маклин (McLean, 1918a; Mojib, 2009).Ранние микробиологические работы по изучению антарктических пресноводных озерныхсистем проводились с использованием классических методов культивирования и прямогомикроскопирования водных образцов (Pearce et al., 2003). Одними из первых подобного родаисследований проводились на озерах островов Субантарктики, а также на континентальныхозерах Ванда и Бонну (Goldman, 1967; Чеботарев, 2003). Применение же молекулярнобиологических методов для изучения разнообразия и экологии микроорганизмов в природныхобразцах началось примерно с конца 1980-х годов (Head et al., 1998).
Данные методы, основанныена изучении последовательности ДНК, полностью перевернули представление о микробномразнообразии в природе, существенно расширив возможности изучения любых экониш, в томчисле и холодных мест обитания (Брюханов, 2012). Общепринятым в данный момент являетсямнение, что культивированию поддаются менее 0,1 % видов прокариот, существующих на Земле.Наиболее популярными молекулярно-биологическими методами изучения бактериальныхсообществ антарктических озер являются: метод разделения в градиентных гелях иклонирования ампликонов генов 16S рРНК (Huang et al., 2013; Villaescusa et al., 2013; Michaud etal., 2012; Kojima et al., 2014), ДГГЭ (Foreman et al., 2011; Karr et al., 2003; Villaescusa et al., 2010;Schiaffino et al., 2009), а также FISH-гибридизация, при условии достаточности биомассы (Pearceet al., 2003; Pearce, 2005).Нередко для более полного “вскрытия” микробного разнообразия некоторые авторыиспользуют комбинацию сразу из нескольких методов (Huang et al., 2013; Foreman et al., 2011).Например, Дэвид Пирс первым применил для изучения бактериального разнообразия впресноводном антарктическом озере Мох одновременно методы ДГГЭ (денатурирующийградиентный гель-электрофорез) и FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) (Pearce et al.,2003).Краеугольным камнем в любом исследовании микробного разнообразия, в особенности приработе с образцами с низкой биомассой, является проблема контаминации образцов чужероднойДНК.
Игнорирование или недолжная степень внимания к этой крайне острой проблеме приводитк ошибочным, а зачастую и к совершенно противоположным результатам и выводам. Яркимпримером этому являются данные, полученные в процессе изучения атмосферного и озерногольда подледникового озера Восток (Антарктида).
Так, методом проточной цитофлуориметриибыло определено общее содержание клеток в концентрированных образцах воды атмосферногои озерного льда типа 1 и 2 над озером Восток, которое оказалось в пределах 0 – 24 кл/мл воды(Булат и др., 2009). Полученные авторами данные на 2 – 3 порядка оказались ниже, чем15опубликованные ранее (Priscu et al., 1999; Karl et al., 1999). Помимо этого, почти все филотипы,выявленные методом молекулярного клонирования, после тщательного анализа былиоднозначно отнесены к контаминантам (Bulat et al., 2004), что опять же, абсолютно несогласуется с опубликованными ранее результатами (Priscu et al., 1999; Karl et al., 1999).
В связис этим при работе с подобного рода объектами первостепенной важностью является задачапредотвращения загрязнения чужеродной микробиотой при отборе и последующей обработкеобразцов льда или воды (Bulat et al., 2004; Булат и др., 2009).Известно, что метод ПЦР, несмотря на огромные преимущества, обладает недостатками, средикоторых основным является преимущественная амплификация одних молекул перед другими(Нетрусов, 2004) в связи с тем, что используемые так называемые «универсальные» праймеры“покрывают” лишь часть известных бактериальных филумов. Именно поэтому внимание ученыхсосредоточилось на оптимизации этого революционного метода, в то время как экстракции ДНК,не менее важному этапу в изучении природных образцов, уделялось несравненно меньшеевнимание.
Неоднократно показано, что не только различные методы, например, энзиматическийи механический способ разрушения клеток, на выходе дают неодинаковые результаты, но дажеразные коммерческие наборы в рамках одного метода экстрагируют ДНК, концентрация которойможет отличаться в несколько раз (Lakay et al., 2007; Nocker et al., 2007; Delmont, 2012).Удивительно, но, несмотря на эти факты в некоторых современных публикациях, посвященныхбактериальному разнообразию антарктических озер, авторы в качестве способа экстракции ДНКиспользуют кипячение (Mojib, 2009), что явно недостаточно для разрушения клеток ивысвобождению гДНК.Наиболее распространенным методом выявления микробного разнообразия в пресноводныхводоемах Антарктиды в настоящее время является метод молекулярного клонирования споследующим секвенированием по Сэнджеру (Villaescusa, 2013; Kojima et al., 2014) илипиросеквенированием ампликонов генов 16S рРНК. К безусловным преимуществам методамолекулярного клонирования относится его высокое филогенетическое разрешение полученныхОТЕ (операционная таксономическая единица), что способствует однозначной идентификациивыявленных филотипов в различных мировых базах данных (Nocker et al., 2007), а значит,выявлениюихметаболическогопотенциалаифизико-химическиххарактеристик,поддерживающих метаболизм и клеточное деление, исходя из свойств коллекционногоматериала.
Минусами данного подхода считаются его относительная сложность (трудоемкость),проблематичность в выявлении редких членов сообществ (неполное “покрытие” библиотек), атакже возможная избирательность генов при амплификации (Нетрусов, 2004), что зависит отиспользуемых праймеров. Последним “грешит” и метод пиросеквенирования ампликонов генов16S рРНК.16Метод ДГГЭ имеет ряд несомненных преимуществ, в сравнении с молекулярнымклонированием. Однако, этот метод пригоден для сравнительно большой биомассы и задач,ставящих сравнение различных экониш или временных интервалов существования сообществ вданных эконишах. Если речь идет об изучении одного образца и разового получения данныхметод теряет свою значимость, т.е. он позволяет получить оценку разнообразию бактериальногосообщества в процессе изменений факторов среды (Нетрусов, 2004).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
