Автореферат (1145486), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Для проверки этого предположения были выбраны синтетическиефосфорилированные пептиды SSNGHV(pY)GKLSSI (ранее исследованный приопределении сорбционной емкости сорбентов) и FGE(pS)AGAAS, а также егонефосфорилированный аналог FGESAGAAS Данные приведены в таблице 3.Таблица 3. Степень связывания пептидов с РММС Fe(III).Пептидадсорбция относительно начальной нагрузки, %SSNGHV(pY)GKLSSI67 ± 2FGE(pS)AGAAS52 ± 2FGESAGAAS9±1Как и следовало ожидать, к РММС Fe(III) исследуемые пептиды имеют различнуюспецифичность: на РММС Fe(III) пептид, фосфорилированный по тирозину,сорбируется в более высокой степени, чем фосфорилированный по серину.
Этообъясняется тем, что в тирозине гидроксильная группа, по которой идетфосфорилирование, отделена от карбоксильной и аминной групп бензольнымкольцом. Это приводит к активации фосфорилированного фрагмента.Нефосфорилированный пептид адсорбируется значительно хуже.Также была изучена адсорбцияпептидов SSNGHV(pY)GKLSSIиFGE(pS)AGAAS на РММС Fe(III) при различной температуре. Из приведенных нарис.23 зависимостей следует , что с увеличением температуры адсорбция, как иследовало ожидать , уменьшается.Рис.23. Изотермы адсорбциипептида SSNGHV(pY)GKLSSIпри 20ºС, 30ºС и 40ºС: наРММС Fe(III).Используя линеаризованное уравнение Ленгмюра (Cв растворе/Г = 1/(Г∞·К) + С/Г∞, ) иуравнение изотермы Вант-Гоффа (ΔH°-TΔS° = -RT·lnK ), были определеныосновные термодинамические параметры адсорбции пептидов на РММС Fe(III).Результаты представлены в табл.
4Таблица 4. Термодинамические характеристики адсорбции пептидов на РММСFe(III).СорбентПептидSSNGHV(pY)GKLSSIРММСFe(III)FGE(pS)AGAASt,ºСК,ΔH0,ΔS0,мл/мкмоль кДж/моль Дж/моль·К2095530505402432015430744039-16.8±254±9-8.6±165±9Полученные данные подтверждаютсделанный ранее вывод, что пептиды,фосфорилированные по тирозину адсорбируются лучше, чем фосфорилированныепо серину. Из приведенных данных следует, что в процессе адсорбции пептидов наповерхности пленок Ленгмюра-Блоджетт энтропия процесса увеличивается. Этоможет быть объяснено тем, что изученные пептиды имеют один сайтфосфорилирования и таким образом прикрепляются к поверхности только однойсвязью. Хвосты же располагаются в растворе и могут иметь большое числоконформаций, что и приводит к росту энтропии.Для использования структур на основе коллапсированных монослоев стеаратажелеза в качестве сорбентов в металл-аффинной хроматографии необходимо знатьстепень извлечения фосфорилированных пептидов из многокомпонентной смеси.
Сэтой целью исследовался ряд элюентов для десорбции c РММС Fe(III) на примерепептида SSNGHV(pY)EKLSSI.Таблица 5. Степень извлечения пептида SSNGHV(pY)EKLSSI.ЭлюентСтепень извлечения, %0.4M NH4OH40 ± 10.5% пиперидин63 ± 30.05% ДСН в 0.5% пиперидине13 ± 2Специфичностьадсорбционных свойств РММС Fe(III) была изученана смеси различныхфосфорилированных пептидов.
С этой целью было проведено исследование болееширокого круга пептидов, а именно: смесь 8 пептидов-фрагментов тау-белка,SSNGHV(pY)EKLSSI, FGE(pS)AGAAS, FGESAGAAS, взятых в равных количествах(таблица 6). В качестве сорбента сравнения был выбран коммерческийжелезосодержащий Iron Affinity Gel. Все сорбенты были взяты в равных количествахпо сухой массе.Таблица 6. Синтетическиех пептиды№Аминокислотная последовательность пептида ИЭТ[M+H]+1SRTPSLPTPPTREPK10.83 1663.9131pSRpTPSLPTPPTREPK7.071743.8791ppSRpTPpSLPTPPTREPK5.051823.8462VAVVRTPPKSPSSAK11.17 1523.8912pVAVVRpTPPKSPSSAK8.671603.8572ppVAVVRpTPPKpSPSSAK6.981683.8243TDHGAEIVYKSPVVSGDTSPR5.352215.1003ppTDHGAEIVYKpSPVVSGDTpSPR4.032375.0324FGESAGAAS4.00796.3454pFGEpSAGAAS3.30876.3145pSSNGHVpYEKLSSI7.821500.673Анализ,проведенныйметодомметалл-аффиннойхроматографиивоптимизированных условиях с последующим ВЭЖХ-МС детектированием показал,чтоисследуемый сорбент демонстрирует высокую селективность кфосфорилированным пептидам (1р, 1рр, 2р, 2рр, 3рр, 4р, 5р) по сравнению снефосфорилированными (1, 2, 3, 4) (рис.
24.). Хорошо видно, что последниепрактически отсутствуют в элюате, тогда как первые имеют сравнительно высокуюстепень извлечения. Следует отметить также более высокую специфичностьвыделениядифосфорилированныхпептидовпосравнениюсмонофосфорилированными,Причем для монофосфорилированных пептидовсуществует четкая зависимость между ИЭТ пептида и его степенью извлечения. чемниже значение ИЭТ, тем выше степень извлечения.Рис.24. Диаграммыстепеней извлечениясинтетическихпептидов послеметалл-аффиннойхроматографии на:А-РММС Fe(III),Б- Iron Affinity GelАБИон железа Fe является жесткой кислотой в соответствии с теорией жесткихи мягких кислот и оснований (принцип Пирсона).
Поэтому наиболее эффективно нанем адсорбируется жесткое основание (фосфорилированные белки). Ионы медиявляются кислотами средней силы. Следовательно, для них следует ожидатьхорошего результата для оснований средней силы (атомов азота).
Для проверки+3высказанного предположения, было проведено исследование адсорбции гистидинмеченных белков на коллапсированных пленках CuSt2. В качестве объектаисследования был выбран белок, имеющий последовательность, состоящую из более150 аминокислот, к концу которой пришиты 6 гистидинов, имеющих в своем составеатомы азота.Возможность использования ПЛБ на основе стеарата меди (РММС (CuII)) вкачестве МАС определялась по той же методике, что и для РММС Fe(III).Результаты представлены на рис.25.Плёнкастеаратамеди(II)перенесенная на кремниевуюподложкупотехнологииЛенгмюра-Блоджетт.Образецснанесённымгистидин-меченым белком.Образец после десорбции врастворе 0,4М NH4OH.Рис.25. Изображения стадий эксперимента в 3DВидно, что адсорбированные частицы, идентифицированные нами, какагрегаты белка, были удалены с поверхности сорбента практически полностью.
Этоделает обоснованным предположение, что данные структуры могут быть так жеиспользованы в качестве металл-аффинных сорбентов в протеомных экспериментах.На данном сорбенте была изучена адсорбция глифосата и продуктов егоразложения. Глифосат – 2-[(фосфонометил)амино] уксусная кислота рисунок 26 (А))– послевсходовый, неселективный гербицид системного действия, используемыйдля уничтожения однолетних и многолетних сорняков.Основным метаболитом глифосата в почве, воде и растениях являетсяаминометилфосфоновая кислота (АМФК) (рис. 26 (Б)). По химической структуреАМФК близка к глифосату, однако она обладает слабой токсичностью.АРис.26.кислоты (Б)БСтруктурные формулы глифосата (А) и аминометилфосфоновойКоличественный анализглифосата и аминометилфосфоновой кислотыпроводили методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связаннойплазмой. Показано, что степень извлечения данного гербицида при использованиисорбента РММС (CuII) превышает 80% (Рис.
27.).Таким образом, было показано, что метод металл-аффинной хроматографиинаколлапсированных ПЛБможет быть эффективно использован припробоподготовке для качественного и количественного анализа водорастворимыхтоксичных веществ, обладающих активными функциональными группами. Методотличается простотой и высокой эффективностью. В связи с этим данный методимеет широкие перспективы в токсикологическом анализе.Рис.27. Диаграммы степеней извлечения глифосата и АМФК после металлаффинной хроматографии на РММС Cu(II)В VII главе представлены результаты по исследованию электрохимических системна основе ПЛБ, содержащих гибридные материалы.
Исследования гибридныхматериалов, в которых совмещены свойства органических и неорганическихвеществ, набирают все большую популярность. Такие материалы могут бытьполучены путем прямого синтеза, кристаллизации, самоорганизации или же спомощью метода Ленгмюра-Блоджетт. Существует два способа получения ПЛБ наоснове гибридных метериалов. Первый заключается в непосредственном синтезенеорганических фрагментов в МС ПАВ, второй – формирование ПЛБ из гибридныхматериалов.
К первому способу относится ПЛБ на основе монослоевоктадециламина, содержащих частицы берлинской лазури (БЛ) и ее аналогов. Дляполучения на основе таких пленок электодоактивных материалов необходимо,чтобы частицы БЛ и ее аналогов в большом количестве и равномерно встраивалисьв ПЛБ.1 мин.35 мин.15 мин.55 мин.Рис.28.МикрофотографиимонослояОДА/Берлинскаялазурь (микроскопияБрюстера) .Для этого была разработана методика введение в монослой частиц берлинскойлазури и ее аналогов путем последовательного ввода реагентов в субфазу.Образование нерастворимых гексацианоферратов в монослое было подтверждено спомощью микроскопии Брюстера (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
