Автореферат (1145464), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Использование количественныхоценок этих и других межпротонных расстояний, полученных с помощью ЯЭО, и ихсравнение с данными РСА или расчетных методов являлись основнымдоказательством при идентификации этих стероидов. На рисунке 13 показанапроцедура определения скоростей кросс-релаксации σij с использованиемзависимостей абсолютных (а) и относительных (б) интенсивностей кросс-пиков вспектрах NOESY стероида (13) от времени смешивания τm.
Во втором случаеэкспериментальная погрешность определения σij для наиболее короткого эталонногорасстояния r12α-12β = 1.77 Å составляет ±1.5%, а для расстояния r1-12α = 3.02 Å ‒ ±5.7%.Это должно обеспечивать экспериментальную погрешность определения расстоянийне хуже ±0.5% и ±2.0%, соответственно. Однако, эти погрешности не являютсяопределяющими точность ЯМР-расстояний.
Это видно при сопоставлении ЯМРданных, полученных с использованием изотропной (Рис. 13-в) и анизотропной (Рис.13-г) моделей расчета, с расстояниями, полученными методом MM+.Рис. 13. Зависимости а) – абсолютных (Sij) и б) – относительных (Sij/Sii) интегральныхинтенсивностей кросс-пиков в спектрах NOESY стероида (13) от времени смешивания τm.Корреляция экспериментальных (ЯЭО) и расчетных (ММ+) межпротонных расстояний дляв) – изотропной и г) – анизотропной моделей обработки ЯМР-данных.Хорошо видно, что выбор в качестве эталонного.
расстояния между геминальнымипротонами при атоме С12, радиус-вектор которого имеет полярный угол βэт. = 35°, вслучае использования анизотропной модели расчета приводит к относительнонебольшому, но вполне заметному улучшению всех параметров, характеризующихлинейную корреляцию между данными ЯМР и ММ+ (параметры линейнойкорреляции А + ВХ, r и sd приведены на рисунках 13-в и 13-г).На рисунке 14-в показана корреляция ЯМР-расстояний в В-нор-D-гомо-9β-аналогеэстрогенов (15), пространственная структура которого приведена на рисунке 14-б, сданными РСА, которые были предварительно оптимизированы методом ММ+ прификсированных координатах тяжелых атомов (С, О).
Межпротонные ЯМРрасстояния были получены с использованием в качестве эталонного расстояниямежду протонами 1 и 2, которое имеет небольшой (около 15º) полярный угол βэт.,а анизотропный вклад в точность определения расстояний был вычислен длярасчетного (ММ+) параметра анизотропии диффузии D║/D┴ = 3.7. Особенностью22процедуры определения расстояний в стероиде (15) было повторение (до 4-х раз)регистрации спектров NOESY с одинаковым значением τm (τm = 0.2, 0.3, 0.4 и 0.5 с) ипоследующим усреднением полученных результатов.
Это было вызванонеобходимостью точного интегрирования наиболее слабых по интенсивности кросспиков, соответствующих расстояниям более 3.0 Å.Рис. 14. а) – Фрагменты спектра NOESY (τm = 0.5 с) стероида (15) и б) - пространственнаяструктура этой молекулы, на которой двойными стрелками указаны все обнаруженные ЯЭО.в) ‒ Корреляция межпротонных ЯМР-расстояний, полученных с помощью анизотропноймодели расчета, с данными РСА, оптимизированными методом ММ+.Таким образом, согласно полученным результатам, только одно из 24-х расстоянийоказалось за пределами погрешности ±5%.
Это расстояние r6α-14α и оно на 8% большесоответствующих данных РСА. Все остальные значения, включая r1-9β, r1-12α и r4-6β,которые превышают 3.0 Å, вполне соответствуют данным РСА. К этому нужнодобавить, что в спектре NOESY стероида (15), кроме указанных выше наиболеехарактерных для 9β-аналогов эстрогенов пространственных взаимодействий, хорошовидны также кросс-пики между сигналом 13β-метильной группы и сигналамипротонов 8β и 9β. Однако, из-за подвижности метильных протонов этивзаимодействия не могут быть использованы на количественном уровне.Использованиескалярныхконстантдлясравнительногоизученияпространственного строения D-гомо- и В-нор-D-гомо-9β-аналогов эстрогенов былопроведено на примере сопоставления для 9β-аналогов (12) и (15) относительныхрасчетных и экспериментальных вицинальных констант ∆3J = 3J(15) ‒ 3J(12) иторсионных углов ∆θ = θ(15) ‒ θ(12) (Рис.
15). Совершенно очевидно, что наиболеесущественные различия между пространственными структурами сравниваемыхстероидов имеются в области сочленения колец B и C. Однако, использованиеодинаковой карплусовской зависимости для шестичленного и пятичленного кольца Вможет приводить к дополнительным ошибкам при расчете ∆3J и ∆θ. Поэтому для23сопоставлениябылииспользованы 5 вицинальныхконстант (3J9β-11α, 3J9β-11β, 3J11α-12α,3J11α-12β, 3J11β-12β) между протонами,находящимися в циклогексановомкольцеСсравниваемыхстероидов. Несмотря на то, чторазличиясоответствующихРис. 15.
Корреляции относительных эксперименторсионных углов не превышаеттальных и расчетных различий а) – вицинальных8º, а различия вицинальныхконстант ∆3JH-H и б) – торсионных углов ∆θН-Н дляконстант находятся в пределахстероидов (12) и (15).±1.0 Гц, наблюдается хорошаякорреляция между экспериментальными и расчетными данными.Другим примером использования скалярных констант для сравнительногоконформационного анализа 9β-аналогов (12) и (15) является сопоставление величиндальней константы 4J1-9β, которая зависит от ориентации протона 9β по отношению кплоскости ароматического кольца А.
Торсионный угол Н9β-С9-С10-С1 для стероида(12) согласно расчетам (ММ+) составляет 83.7°, а для В-нор-D-гомо-9β-аналога (15)он равен 88.9°. При точном определении константы 4J1-9β для этих стероидов былообнаружено полное соответствие с результатами расчетов: 4J1-9β(12) = (1.27±0.02) Гц,4J1-9β(15) = (1.43±0.02) Гц.3.2. 13α-Аналоги эстрогеновПространственное строение 13α-аналогов стероидных эстрогенов в растворе былоисследовано на примере изучения стероидов (16) – (18).
Отличительнойособенностью протонных спектров этихмолекул является их крайняя сложность из-заналичия большого числа сильносвязанныхспиновых систем, поэтому основные усилиябылипредпринятывнаправленииидентификации сигналов с привлечениемгомо- и гетероядерных корреляционныхметодов спектроскопии ЯМР и активногоиспользованиясимуляцииразличныхспиновых подсистем. В результате для всех13α-аналогов были получены полные наборыпротонных и углеродных химических сдвигов,скалярных констант 2-6JH-H и обнаруженынаиболее важныедля доказательствапространственного строения этих соединений пространственные взаимодействия(ЯЭО). Например, для доказательства принадлежности стероида (16) к 13α-аналогамэстрогеновдостаточнопроанализироватьсовокупностьпространственныхвзаимодействий протонов метильной группы в положении 13 с окружающимипротонами (Рис. 16).Прежде всего, взаимодействие 13-Ме/14α однозначно свидетельствует оцис-сочленении колец С и D, а кросс-пики 13-Ме/12α и 13-Ме/12β, также как13-Ме/14α и 13-Ме/15α, доказывают экваториальное положение этой метильнойгруппы в кольце С и соответствующую пространственную ориентацию 5-членного24кольца D.
Кроме того, для стероида(16) характерна пространственнаясближенность протонов 9α, 14α и7α, 14α. Помимо этого, в спектреDQF-COSY обращают на себявнимание крайне слабые кросспики, соответствующие дальнимскалярнымвзаимодействиямW-типа протонов 13α-метильнойРис. 16. Конформация молекулы 13α-аналога группы с протонами 14α и 16α, аэстрогенов (16), на которой двойными стрелками также между ними.На рисунке 17-а в качествепоказаны пространственные взаимодействия,обнаруженные в спектре NOESY.примерапоказанапроцедураанализа спектра 13α-аналога (16) спомощью симуляции подспектра одной из сильносвязанных систем (16α, 16β и 15α),находящейся в области 2.05 ‒ 2.45 м.д., где располагаются сигналы 6-ти протонов.Рис. 17. а) 1. ‒ Симуляция подспектра сильносвязанных протонов 16α, 16β и 15α, 2. ‒фрагмент экспериментального спектра ЯМР 1Н и б) ‒ корреляции экспериментальных ирасчетных торсионных углов θH-H и вицинальных констант 3JH-H 13α-аналога эстрогенов (16).Полученные с помощью симуляции спектров сильносвязанных систем и методовCOSY-DQF, J-COSY и HSQCnd экспериментальные данные по оценке всех значенийвицинальных констант 3Jijэксп.
между протонами в кольцах В, С и D стероида (16)были использованы для определения соответствующих торсионных углов θijэксп.. Этипараметры были сопоставлены в виде корреляционных зависимостей с ихрасчетными значениями 3Jijрасч. и θijрасч. (Рис. 17-б), полученными на основанииоптимизации геометрии этой молекулы методом ММ+. Результаты такогосопоставления свидетельствуют о достаточно высоком уровне соответствия междуэкспериментальными и расчетными значениями торсионных углов θH-H (sd = 2.7º) ивицинальных констант 3JH-H (sd = 0.41 Гц).3.3. D-Гомоаналоги эстрогенов природного рядаПространственное строение стероидных эстрогенов природного ряда было изученона примере D-гомоаналогов (19), (20) и 6-окса-D-гомоаналога (21).
Посколькупространственное строение колец В и С стероидов природного ряда (19) и (20) ирассмотренных выше 13α-аналогов эстрогенов во многом совпадает, то протонныеспектры этих стероидов имеют много общего, поэтому, также как для 13α-аналогов,анализ мультиплетной структуры сигналов протонов кольца В в спектрах ЯМР 1Нстероидов (19) и (20) проводился с помощью комбинированного использованияданных корреляционных спектров (COSY-DQF, NOESY, HSQCnd, J-COSY) и25симуляции подспектров сильносвязанных протонов с учетом всех других (включаядальние) скалярных взаимодействий.Результаты этого анализа дают полный набор скалярных констант междупротонами колец А и В, который практически совпадает с аналогичными данными,которые были получены для 13α-аналогов эстрогенов.Наиболее надежным доказательством принадлежности стероидов (19) – (21) кприродному ряду является набор пространственных взаимодействий междупротонами, который был получен в результате анализа их спектров NOESY.
Вкачестве примера на рисунке 18 с помощью двойных стрелок показаны всепространственные взаимодействия в молекуле 6-окса-D-гомоаналога (21),обнаруженные в виде кросс-пиков вспектре NOESY.Наиболееважнымидлядоказательстваявляютсяпространственные взаимодействияв β-области этой молекулы междупротонами метильной группы приатоме С13 и ближайшими к нейаксиальными протонами 11β, 8β,15βи17β,атакжесэкваториальным протоном 12β.Рис. 18.Конформация 6-окса-D-гомоаналога Между этими β-протонами такжевзаимодействияэстрогенов природного ряда (21), на которой наблюдаютсядвойными стрелками показаны обнаруженные в 12β/11β, 11β/8β, 8β/15β и 15β/17β,которые характерны для структурыспектре NOESY взаимодействия.стероида (21).Не менее существенным подтверждением строения этой молекулы служатобнаруженные пространственные взаимодействия в ее α-области: 9α/12α, 9α/14α,9α/7α, 12α/14α, 7α/14α, 14α/16α, 14α/17aα, 16α/17aα и 17аα/12α.Совокупность всех перечисленных пространственных взаимодействий однозначносвидетельствует о том, что кольца С и D находятся в конформации “кресло”, а самстероид (21) имеет “транс”-“транс” сочленение колец В/C и C/D и, следовательно,принадлежитприродномуряду.Изперечисленныхпространственныхвзаимодействий были выбраны 10 пар протонов, для которых были измереныскорости кросс-релаксации σij и с помощью калибровочного метода сделаны оценкимежпротонных расстояний (Рис.
19). В качестве эталонного расстояния было выбранозначение 2.45 Å между вицинальными протонами 1 и 2 в ароматическом кольце А.В процедуру обработки данных входил учет анизотропии вращательной диффузиипри параметре анизотропии D║/D┴ = 10.26Рис. 19. Корреляция межпротонных ЯМР-расстояний,полученныхспомощьюанизотропной модели расчета, с данными а) ‒ РСА иб) ‒ метода ММ+.Полученные результаты ЯМР-измерения межпротонных расстояний в стероиде(21) хорошо (в пределах ±5%) согласуются с данными РСА (Рис. 19-а) и срезультатами расчетного метода ММ+ (Рис. 19-б).3.4 9β,14β-Аналоги эстрогеновПринадлежность стероидов (22) и (23) к 9β,14β-аналогам эстрогенов была доказанас помощью количественных оценок скалярных констант и качественных оценокмежпротонных расстояний.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
