Автореферат (1145464), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Пунктиром показан диапазонвносимых погрешностей при значениях параметра D║/D┴ = 12±2.Параметр анизотропии А может быть получен путем определения моментовинерции вокруг главных осей аксиально-симметричной молекулы, рассчитаннойметодами ММ. Однако, этот способ не учитывает влияние растворителя, поэтому вработе было предложено и реализовано экспериментальное определение параметра10D║/D┴, основанное на сопоставлении гетероядерных эффектов Оверхаузера (HOE) отдвух геминальных протонов метиленовой группы, находящейся в одном из колецстероидной молекулы, на соседний атом углерода (Рис.
2).Для проверки возможности использования данного подхода была выбранастероидная молекула (11в), в которой метиленовая группа С17Н2 расположенаотносительно главных осей молекулы так, что радиус-вектор связи С17–Нβ направленпрактически ортогонально оси “с”, а радиус-вектор связи С17–Нα оказывается вдольэтой оси (спектральные характеристикиВ-нор-8α-аналогаэстрогенов(11в)рассмотрены в главе 2). Посколькумежъядерные расстояния rС17–Нβ и rС17–Нαможносчитатьодинаковыми,тосоотношениеинтегральныхинтенсивностей кросс-пиков Нβ/С17 иНα/С17 в спектре HOESY, котороесоставляет 2.9 : 1.0, отражает толькоэффект анизотропии диффузионногодвижения.Следовательно,экспериментальная величина параметраанизотропии составляет примерно 12±2,что почти в 2.5 раза больше еерасчетного значения.
Это превышениеРис. 2. Экспериментальное определениесоответствует литературным данным параметра анизотропии диффузии D /D в║┴(FujiwaraH.etal.,1990)по стероиде (11в) с помощью метода HOESY.экспериментальной оценке параметраанизотропии диффузии, полученным для тестостерона путем измерения времен спинрешеточной релаксации атомов 13С: (D║/D┴)эксп. = 14±2, (D║/D┴)расч. = 5.2.На рисунке 3 показаны корреляции данных ЯМР для 14 расстояний в 6-окса-8αаналоге эстрогенов (2а) с соответствующими результатами РСА до (А) и после (Б)введенияпоправкинаанизотропию.Привыбореэталонногорасстояния r7α-7β = 1.78 Å, радиусвектор которого ориентированпочти ортогонально главной осиэтого стероида, и использованииизотропной модели расчета (А)толькодля6расстоянийРис.
3. Сопоставление с данными РСА отклонение от данных РСА немежпротонных расстояний в стероиде (2а), превышает ±5% (здесь и далеепоказанаполученных с помощью ЯЭО для А) ‒ изотропной и погрешность ±5%В) ‒ анизотропной моделей расчета.пунктирными линиями), а 8расстоянийоказываютсязначительно заниженными (показаны закрытыми кружками ●). После введенияпоправки на анизотропию диффузии (Б), практически для всех расстояний,расхождение между результатами использования ЯЭО с анизотропной поправкой исоответствующими данными РСА не превышает ±5%.
К этому следует добавить, чтодля конформационно жестких стероидных молекул при измерении сравнительно11небольших (до 3.5 Å) межпротонных расстояний другие возможные вклады впогрешность, такие как эффекты спиновой диффузии или вклады нуль-квантовойкогерентности, согласно расчетам не должны превышать 3%. Следовательно,анизотропный вклад в погрешность оценок расстояний в жестких стероидныхмолекулах является доминирующим и он может быть вычислен и устранен.
Другиепримеры количественных оценок расстояний, которые рассматриваются в главах 2-5,подтверждают этот вывод.Высокая точность измерения межпротонных расстояний (в пределах ±5%) спомощью ЯЭО открывает новые возможности для обнаружения быстрых в шкалевремени ЯМР конформационных превращений. Это связано с нелинейнойзависимостью эффективного расстояния < r > от населенностей конформеров. Нарисунке 4 эта зависимость представлена для простейшего случая двухпозиционногообмена (А)(В), при котором происходит изменение межпротонного расстояния от3.0 Å в доминирующем конформере (А) до 2.0 Å в минорном конформере (В).Рис. 4.Зависимость эффективного расстояния < r > от населенности конформера (В).Из-за сильной зависимости скорости кросс-релаксации σ от расстояния r (σ ~ 1/r6)достаточно присутствия в равновесии менее 10% минорного конформера (В) с болеекоротким расстоянием, чтобы наблюдаемое расстояние < r > уменьшилось на 30% исоставило 2.7 Å.
Поэтому, при точности определения расстояний не хуже ±5%,зарегистрированное значение 2.7 Å выходит за пределы погрешностей измерения исвидетельствует о присутствии минорного конформера (В). Чувствительность этогоспособа оценки населенности минорного конформера сильно зависит от диапазонаизменения расстояния и при их разнице в 2.0 Å (например, rA = 4.0 Å, rB = 2.0 Å)можно зарегистрировать минорный конформер (В) с населенностью около 2%.В условиях быстрого в шкале времени ЯМР конформационного обмена встероидных молекулах, для которых характерно перекрываниесигналовскалярносвязанных протонов и существование сильносвязанности между некоторымииз них, нельзя исключать проявления скалярной релаксации 1-го рода.
Она возникаетпри конформационном обмене из-за быстрого изменения величины скалярнойконстанты между протонами и в случае их сильносвязанности может вноситьсущественный вклад не только в поперечную, но и в продольную релаксациюмагнитных ядер. Следовательно, при регистрации спектров NOESY конформационномобильных стероидных молекул вполне возможны проявления эффектов скалярнойрелаксации 1-го рода, которые в условиях экстремального сужения линий (ωоτс << 1)должны приводить к уменьшению наблюдаемой интенсивности кросс-пиков,связанных с вкладом в кросс-релаксацию диполь-дипольного механизма.12Таким образом, скалярная релаксацияможет приводить к завышениюмежпротонных расстояний в малых молекулах, но этот же скалярный вклад в кроссрелаксацию для больших молекул вусловиях спиновой диффузии (ωоτс >> 1)дает противоположный эффект ‒ онприводит к увеличению интенсивностикросс-пикаи,соответственно,кзаниженным оценкам межпротонныхрасстояний (Рис.
5).Хотятеоретическоеописаниемеханизма скалярной релаксации былосделано А. Абрагамом еще в 1961 году,известны лишь несколько доказанныхпримеровэкспериментальногонаблюдения этого явления. Поэтомупримерырегистрациианомальныхэффектов скалярной релаксации, которыеРис. 5.Зависимости интенсивностей были обнаружены в спектрах NOESYкросс-пиков в спектре NOESY от времени конформационно мобильных 6-окса-Dэстрогенов,смешивания Iij = ƒ(τm) при отсутствии гомо-8α,14β-аналогахскалярной релаксации и при ее присутствии представляют как практический, так(пунктирные линии) для случаев малых и теоретический интерес. Они рассмотреныбольших молекул.в третьей главе диссертации (раздел 3.5).Обоснованные в первой главе наиболее перспективные направления методологииЯМР-исследования стероидов были всесторонне апробированы при изучении 8αаналогов эстра-1,3,5(10)-триенов (1) – (11), которым полностью посвящена втораяглава, и примеры исследования которых приведены на рисунках 2 и 3.
Затемполученный опыт и проверенные на 8α-аналогах методологические подходы былираспространены на 5 других изоаналогов эстрогенов (12) ‒ (25), результатыисследования которых представлены в третьей главе. В 4-й главе аналогичныйподход применен для изучения аналогов эстратетраенов (26) ‒ (35) и эстрапентаенов(36) ‒ (44), а в заключительной 5-й главе представлены несколько примеровисследования модифицированных аналогов стероидных андрогенов (45) ‒ (50).Глава 2. Конформационный анализ 8α-аналогов эстрогенов на основеданных спектроскопии ЯМРНеобходимым условием конформационного анализа стероидных гормонов врамках предлагаемой методологии является полное отнесение всех протонныхсигналов, включая перекрывающиеся между собой и образующие сложныесильносвязанные системы мультиплетных сигналов в алифатической области спектраЯМР 1Н.
Эта задача была и остается крайне сложной даже при использованиисовременных спектрометров и возможностей различных гомо- и гетероядерныхкорреляционных методов в одном и двух измерениях. Здесь уместно вспомнить, чтоопубликованное в 1990 году (Hayamizu K. et аl.) полное отнесение протонныхсигналов на частоте 600 МГц даже такой известной молекулы как тестостероннеоднократно подвергалось сомнению вплоть до 2011 года (Aspers R. L. E. G. et al.).13Изложение результатов для 8α-изоаналогов эстрогенов начинается с самыхпростых в спектральном отношении 6-окса-8α-эстра-1,3,5(10)-триенов (1) ‒ (4), азаканчивается рассмотрением более сложных D-гомо-В-нор-8α-аналогов (9) ‒ (11):14Среди более 20-ти использовавшихся в работе корреляционных методов можновыделить СOSY-DQF, J-COSY, HSQCnd и Fast NOESY1 (F.NOESY это вариантметода NOESY с неполным релаксационным восстановлением ‒ Köck M., GriesingerC., 1994), которых в большинстве случаев оказывалось достаточно для полнойидентификации сигналов.
Лишь в нескольких отдельных случаях использовалисьметоды DQ-COSY, INADEQUATE, HOESY и COLOC. Выбор этих основных ивспомогательных методов спектроскопии ЯМР и выявление их достоинств инедостатков в отношении возможностей изучения стероидных молекул подробноизложены в тексте диссертации на примерах изучения 8α-аналогов эстрогенов.Апробация количественного использования ЯЭО для точной оценкимежпротонных расстояний, являющегося ключевым элементом разрабатываемойметодологии, проводилась как на примерах сопоставления ЯМР-расстояний сданными других методов для нескольких отдельных пар протонов, которые наиболеечувствительны к пространственному строению стероидной молекулы (это расстояниямежду протонами колец А и С и/или В и D), так и путем сопоставления всехрасстояний, имеющих в спектре NOESY отдельные хорошо разрешенные кросс-пикии объемное интегрирование которых можно выполнить с максимальной точностью.Число таких пар протонов невелико и составляло обычно от 10 до 20.На рисунке 6 в качестве примера показан фрагмент спектра F.NOESY D-гомо-Bнор-8α-аналога эстрогенов (11б), на котором прямоугольными рамками отмеченыконтуры объемного интегрирования 9 пар неперекрывающихся кросс-пиков, значенияинтегралов (Sij) которых использованы для определения соответствующих скоростейкросс-релаксации с помощью построения зависимости Sij/Sii = f(τm), где Sii ‒объемный интеграл диагонального сигнала, а τm = 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 и 1.0 с.Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
