Автореферат (1145464), страница 5
Текст из файла (страница 5)
значения на рисунке 10-а)и данными ЯМР: в стероиде (3a) r1-9α < r1-11α, а в стероиде (3б) наблюдается обратноесоотношение: r1-9α > r1-11α. Если в каждом из стероидов выбрать расстояние r1-9α вкачестве эталонного, то получим ЯМР-расстояния: r1-11α(3а) = 2.56 Å, r1-11α(3б) = 2.30 Å,которые меньше их расчетных значений лишь на 0.02 и 0.03 Å, соответственно.Аналогичным образом для стероидов (3a) и (3б) были полученыэкспериментальные оценки расстояний между протоном 7α и протонами 15α и 15β.Исходными данными здесь являлись отношения интегральных интенсивностей:(S7α-15β/S7α-15α)(3а) = 2.8, (S7α-15β/S7α-15α)(3б) = 0.7, на основании которых быливычислены отношения экспериментальных расстояний в этих стероидах:(r7α-15α /r7α-15β)(3a) = (2.8)1/6 = 1.187, (r7α-15α /r7α-15β)(3б) = (0.7)1/6 = 0.942.18Рис.
10. а) и б) – Ньюменовские проекции по связям С3-С2 и С10-С9 и в) – фрагментыспектров NOESY (τm = 0.5 c) стероидов (3a) и (3б). Цифрами под контуром интегрированияуказаны относительные интегральные интенсивности кросс-пиков 1/9α и 1/11α.Если в качестве эталонного выбрать расстояние r7α-15α, то получим: (r7α-15β)(3a) =2.20 Å, (r7α-15β)(3б) = 2.47 Å, что оказывается меньше их расчетных значений на 0.14 и0.16 Å , соответственно. В данном случае интерес представляют не абсолютныезначения расстояний, а их относительные различия, поскольку проводится сравнениестероидов (3а) и (3б) между собой.
Следовательно, на основании данных поизмерению ЯЭО можно утверждать, что по сравнению со стероидом (3a) стерическиевзаимодействия метильной группы в положении 7β в стероиде (3б) приводят кконформационным изменениям в области сочленения колец В и С, результатомкоторых является уменьшение межпротонного расстояния r1α-11α(ЯМР) на 0.26 Å иодновременное увеличение расстояния r7α-15β(ЯМР) на 0.27 Å. Это практическисовпадает с соответствующими данными метода РМ3: уменьшение расстоянияr1α-11α(РМ3) на 0.25 Å и увеличение расстояния r7α-15β(РМ3) на 0.29 Å.Определение межпротонных расстояний с точностью не хуже ±5% открываетвозможность обнаружения быстрых в шкале времени ЯМР равновесныхконформационных превращений.
В качестве примера решения такой задачи нарисунке 11-а представлено сопоставление с данными полуэмпирического метода РМ3экспериментальных ЯМР-расстояний в 7α-метил-6-окса-8α-аналоге эстрогенов (1б),полученных с использованием изотропной модели расчета. В качестве эталона быловыбрано расстояние 2.48 Å между ароматическими протонами 1 и 2, для которогополярный угол между радиус-вектором r1-2 и главной осью молекулы (1б) составляетоколо 10°.Рис.
11. а) – Корреляция экспериментальных (ЯЭО) и расчетных (РМ3) расстояний и б) конформационный обмен в стероиде (1б). Конформеры (А) и (В) показаны в ньюменовскойпроекции по связи С7-С8. Цифрами указаны расчетные значения соответствующихмежпротонных расстояний r7β-15β и торсионных углов Н7β-С7-С8-Н8α.19Несмотря на использование изотропной модели расчета, полученные результатысвидетельствуютохорошемколичественномсоответствиимеждуэкспериментальными и расчетными значениями межпротонных расстояний. Толькодля трех (r9α-11α, r7β-11β и r7β-15β) из восьми расстояний относительное отклонениепревышает ±5% от измеряемой величины.
Поскольку практически все отклонения(кроме ∆r9α-14α и ∆r7β-15β) имеют положительный знак (т.е. rij(ЯЭО) > rij(PM3)), то они могутбыть объяснены влиянием анизотропии диффузионного движения, которое привыборе эталонного расстояния с небольшим полярным углом β должно приводить кзавышенным оценкам тех расстояний, для которых этот угол существенно больше.Например, для расстояний r9α-11α и r7β-11β, которые имеют наиболее завышенныеэкспериментальные значения (на 6.1 и 5.0%, соответственно), полярные углы β9α-11α иβ7β-11β составляют ~80º и ~70°, соответственно.Совершенноочевидно,чтоаналогичноеобъяснениезаниженногоэкспериментального значения расстояния r7β-15β оказывается невозможным, посколькуучет анизотропного фактора при β7β-15β ≈ 30° должен приводить к обратному эффекту– к дополнительному уменьшению этого расстояния примерно на 2%.
Влияниеспиновой диффузии или эффекты скалярной релаксации в условиях, когда ωоτс << 1,могут приводить только к его увеличению, поэтому единственной причинойзаниженного расстояния r7β-15β является динамический процесс, связанный с быстрымв шкале времени ЯМР обменом между двумя (А) и (В) конформерами: (А) (В).В этом случае наблюдаемое значение расстояния r7β-15β является усредненным повремени и определяется как населенностями конформеров РА и РВ, так и значениямиэтого расстояния в каждом из них. Наиболее вероятным вариантом такого обмена длястероида (1б) является изменение конформации кольца В, в результате которогопроисходит изменение псевдоэкваториальной ориентации 7α-метильной группы напсевдоаксиальную (рис.
11-б). При этом протон 7β из псевдоаксиальной ориентации восновном конформере (А), в котором r7β-15β(A) = 3.36 Å, переходит впсевдоэкваториальное положение в минорном конформере (В). Этот приводит кзначительному уменьшению расстояния r7β-15β(В), которое по данным метода РМ3составляет 2.37 Å. Поскольку наблюдаемое расстояние <r7β-15β(ЯЭО)> = 2.9 Å, то дляуказанных граничных его значений в конформерах (А) и (В) была сделана оценканаселенности минорного конформера: РВ ≈ 19%.
Эта величина из-за нелинейногохарактера зависимости <r7β-15β> = ƒ(РВ) определена с большой погрешностью(+12, -8 %), а использование для этой же цели значения наблюдаемой константы<3J7β-8α > = 10.3 Гц и расчетных значений 3J7β-8α(А) = 11.2 Гц, 3J7β-8α( В) = 7.35 Гц даетсопоставимый результат: РВ = 23.4%.Точность определения населенности минорного конформера с помощью ЯЭОзначительно повышается при оценке небольших (менее 10%) значений РВ и приувеличении разницы расстояний в конформерах (А) и (В). На рисунке 12 в качествепримера приведены основные доказательства конформационного обмена (А) (В) встероиде (5б) в виде увеличения суммы констант 3J6β-7α и 3J6β-7β на 0.6 Гц приповышении температуры от 20 до 60 ºС (Рис.
12-1) и обнаружения кросс-пика 6β/11βв спектре NOESY (Рис. 12-3), интегральная интенсивность которого примерно в 3раза больше его расчетного значения для конформера (А). Это соответствуетэффективному расстоянию <r6β-11β> = 3.4 Å, которое на 0.7 Å меньше, чем егорасчетное значение для доминирующего конформера (А).На рисунке 12-4 показан графический способ определения соотношениянаселенностей PA и РВ с помощью построения нелинейной зависимости <r> = ƒ(PA) и20полученного эффективного расстояния <r6β-11β>.
Этот способ дает при 20 °Сследующее соотношение конформеров: PA : РВ ≈ 98 : 2. Поскольку экспериментальнаяпогрешность оценки расстояния <r6β-11β> не превышает ±5% от измеряемого значения(на рисунке 12-4 погрешность определения расстояния ±5% показана пунктиром), тотогда точность определения населенности минорного конформера (B) должна бытьменьше ±1%. Таким образом, точная оценка населенности минорного конформера (В)стероида (5б) составляет 1.7 % (+0.9, ‒0.7 %).На основании сравнения экспериментальных значений константы 3J6β-7α длястероидов (5а) и (5б) при 20 ºС (Рис. 12-1) можно объяснить их различиеприсутствием конформера (В) в растворе стероида (5б), поэтому величину константы3J6β-7α(5а) = 2.3 Гц можно использовать в качестве значения для константы 3J6β-7α(5б) вдоминирующем конформере (А), а для минорного конформера(В) можноиспользовать расчетное значение 13.06 Гц.
Тогда населенность РВ, полученная наосновании наблюдаемой величины <3J6β-7α(5б)> = 2.7 Гц, составляет 3.7%.Рис. 12. 1. ‒ Сигнал протона 6β в спектре стероидов а) ‒ (5а) и б,в) ‒ (5б) при температураха, б) ‒ 20 ºС и в) ‒ 60 ºС. 2. ‒ Конформационный обмен в стероиде (5б), на которомстрелками показаны пространственное взаимодействие 6β/11β и скалярное взаимодействие6β/7α, а цифрами для конформеров (А) и (В) даны расчетные величины расстояния r6β-11β иконстанты 3J6β-7α в Гц. 3. ‒ Фрагмент спектра NOESY стероида (5б), на котором кросс-пик6β/11β выделен окружностью.
4. ‒ Оценка населенности конформеров с помощьюзависимости < r6β-11β > = f(PA).Таким образом, использование ЯЭО и скалярных констант приводит ксопоставимым результатам.Глава 3.Конформационный ЯМР-анализ других изоаналогов эстрогеновПроверенная на 8α-аналогах эстрогенов методология конформационного ЯМРанализа была использована при изучении особенностей пространственного строенияи внутримолекулярной динамики 5-ти других изоаналогов эстрогенов. Характерныепримеры их исследования и обсуждение системы доказательств принадлежности копределенному изоряду, составляет содержание следующих 5-ти разделов.3. 1.
9β-Аналоги эстрогеновПространственное строение 9β-аналогов стероидных эстрогенов в растворе былоисследовано на примере изучения четырех стероидов (12) – (15). Для этих стероидовхарактерны следующие пространственные взаимодействия в β-области с участиемпротона в положении 9: 9β/7β, 9β/8β, 9β/11β и взаимодействие 9β/11α, а также крайнеслабое прямое взаимодействие с протоном 1.21Одновременно с этим в спектре NOESY наблюдается достаточно интенсивныйкросс-пик 1/12α, свидетельствующий о большей сближенности соответствующихпротонов по сравнению с 8α-аналогами эстрогенов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
