Диссертация (1144259), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Для визуализации липидныхфазиспользуютсяфлуоресцентно-меченыепробы,предпочтительносегрегирующиеся в Lo (Dil18:0) или Ld (NBP-PC 16:0) фазы [165].Помимоизучения липид-липидных взаимодействий, ГОЛ могут использоваться дляизучения механизмов токсичности пептидов, распределения мембранных белков,образования тубул или везикул. Применение ГОЛ позволяет изучать модельныемембраны, контролируя липидный состав и экспериментальные условия, такиекак температура и влияние растворителя.ГОЛ являются классической моделью для изучения поведения липидныхсмесей in vitro.
В случаях, когда оказывается успешной реконструкция белка влипидные мембраны, «гигантские» липосомы могут быть использованы для- 40 -биофизическихисследованийбелок-липидныхвзаимодействий.Основнойтехнической трудностью такого рода исследований служит подбор и оптимизацияусловийвстраиванияэкстрагированногомембранногобелкаобратновфосфолипидный бислой.
Среди наиболее часто используемых для этого подходовможно перечислить следующие: диализ детергента, удаление детергента путемадсорбции на гидрофобных смолах, разбавление смесей ниже критическоймицелярной концентрации детергента, гель-фильтрация. При этом добиваютсявезикуляции солюбилизированных молекул фосфолипидов, в результате чегобелок оказывается реконструрованным в липидный бислой.Несмотря на методологические трудности, для ряда белков данный подходоказался успешным.
Большинство белков, встроенных обратно в бислои,сохраняютсвоюфункциональнуюактивность(каналообразующуюилиферментативную), даже в тех случаях, когда последняя была утрачена во времяэкстракции в детергентах (явление реактивации). Полученные протео-ГОЛпригодны для исследования сегрегации белков между Ld и Lo фазами, изученияфизико-химическихсвойствбислоев,изучениярелокализациибелковмембранах различной кривизны, электрофизиологических исследований.в- 41 -ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1 Генетические конструкцииЭкспрессионные конструкции для наработки рекомбинантных белков всистеме E. coli: вектор pMAL-3А-Atxn3-C, кодирующий белок слияния мальтозосвязывающего белка и С-концевого фрагмента атаксина-3 - MBP-Atxn3-C(любезно предоставлена д. Миви Ким), вектора pMAL-3A-Htt-17Q, pMAL-3A-Htt48Q, кодирующие белки слияния мальтозо-связывающего белка и хантингтина MBP-Htt-17Q и MBP-Htt-48Q (любезно предоставлены д. Миви Ким).Генетические конструкции для экспрессии флуоресцентных белков слияниядля экспрессии в клетках линий млекопитающих: хантингтина с зеленымфлуоресцентным белком Htt-17Q-GFP, Htt-48Q-GFP, Htt-82Q-GFP, Htt-138Q-GFP,рецептора сигма-1 с зеленым флуоресцентным белком S1R-GFP (дикий тип), S1RR7ER8E-GFP, S1R-delta7-8-GFP, S1R-4A-GFP, S1R-4G-GFP, S1R-W9LW11L-GFP(полученыавторомличнонаосновевектораpEGFP-N2).ПлазмидаpCSCMA:tdTomato была предоставлена Г.
Раффелом (Addgene # 30530) [184].Плазмида mCherry-ER была предоставлена М. Дэвидсоном (Addgene #55041).Генетическиеконструкциидляэкспрессииполигистидин-меченогорецептора сигма-1 человека S1R-6His в бакуловирусной системе экспрессии:вектор для рекомбинации pFastBac-6His-S1R и соответствующие бакмиды дляэкспрессии получены лично автором (на основе вектора pFastBac-HT, ThermoFisher, США). Экспрессионные конструкции для электронной микроскопии: HRPER (Addgene #79909) [185], белок слияния S1R и пероксидазы Apex2 - S1R-Apex2(получена автором лично на основе вектора pcDNA3.1-Apex2-NES, Addgene#49386) [186].Лентивирусные генетические конструкции для экспрессии в первичныхкультурах нейронов: полигистидин-меченый рецептор сигма-1 LV-S1R-6His иLV-S1R-R7ER8E-6His получены автором лично (на основе лентивируснойконструкции, предоставленной д.
Хуа Жанг).- 42 -2.1.1 Выделение и анализ плазмидных ДНКВыделениеплазмиднойДНК(пДНК)осуществлялосьспомощьюкоммерческого набора NucleoBond Xtra Midi (Marchery-Nagel, Германия).Отдельные клоны клеток штамма DH5a E. coli после трансформацииинокулировалив200-300 млсредыLB,содержащейсоответствующийантибиотик. Ночную культуру осаждали центрифугированием и выделяли пДНКсогласно рекомендациям производителя. Концентрацию и чистоту выделенияпДНК определяли спектрофотометрически по поглощению при 260 нм спомощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США). ДНКанализировали с помощью электрофореза в агарозном геле согласно стандартнымметодикам.2.1.2 Молекулярное клонированиеДля получения генетических конструкций, описанных выше, применялисьстандартные методики молекулярного клонирования.
Для этого в праймеры дляамплификации целевого участка гена вводились сайты для эндонуклеазрестрикции (pEGFP-N2: HindIII/XbaI; pFastBac: HindIII/EcoRI, p-MAL: NotI/PstI,LV:EcoRI/BamHI).Ампликоныивектораподвергалисьобработкесоответствующими ферментами, очищались (Qiagen PCR Clean-up Kit, Qiagen,Германия) и лигировались с помощью T4 лигазы (NEB, США). Кольцевыемолекулы ДНК трансформировались в химически компетентные клетки E.
coliштамма DH5a. Клоны анализировали с помощью полимеразной цепной реакции(ПЦР).Наличиевставкиподтверждалосьрестрикционныманализомипоследующим секвенированием полученных генетических конструкций.2.1.3 Сайт-направленный мутагенезДля получения генетических констукций, кодирующих мутантные формырецептора сигма-1, использовался набор для сайт-направленного мутагенеза Q5Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB, США) в соответствии с рекомендациямипроизводителя. Для этого плазмида амплифицировалась целиком с помощьюпары праймеров, содержащих соответствующие нуклеотидные замены. Прямой и- 43 -обратный праймеры подбирались с помощью программы NEB Changer.
ПЦРпродукт фосфорилировался, лигировался, исходная матрица расщепляласьэндонуклеазойрестрикцииDpnI.ПослеэтогокольцеваяпДНКтрансформировалась в клетки E. coli штамма DH5a. Наличие целевых мутацийбыло подтверждено с помощью секвенирования полученных генетическихконструкций.2.2 Экспрессия, очистка и анализ рекомбинантных белков2.2.1 Экспрессия и очистка белков в экспрессионной системе E. coliРекомбинантные белки слияния MBP-Atxn3-C, MBP-Htt-17Q, MBP-Htt-48Q,а также нативный MBP были экспрессированы в клетках E. coli штаммаBL21(DE3). Для этого соответствующие плазмиды трансформировались в клеткиE.
coli штамма BL21(DE3). Отдельные колонии (5-6 шт) инокулировались вжидкуюсредуLB(10мл),содержащуюсоответствующийантибиотик(ампициллин) и культивировались в течение ночи при 37 °С. Ночную культурупереносили (1:100) в 1 л среды LB с ампициллином и культивировали додостижения оптической плотности OD(600нм)=0,8. Индукцию синтеза белкаосуществлялидобавлениемthiogalactopyranoside)ввпитательнуюконечнойсредуконцентрацииIPTG0,5мМ.(isopropyl-b-D-1Синтезбелкаосуществлялся при 25 °С в течение 5 часов.
Бактериальные клетки осаждалицентрифугированием при 5000 g, клеточный осадок замораживали и хранили притемпературе -80 °С.Очистку белков слияния MBP-Atxn3-C, MBP-Htt-17Q, MBP-Htt-48Q, атакже MBP проводили с помощью аффинной хроматографии с использованиемамилозной смолы (NEB, США). Для этого клеточный осадок (полученный послеосаждения центрифугированием 1 л бактериальной суспензии) ресуспендировалив 50 мл буфера для лизиса (50 мМ Трис-HCl pH=8,0, 150 мМ NaCl, 1% Triton X100, 1 мМ PMSF, 1x C0mplete Protease Inhibitor Roche).
Клетки разрушалиобработкой ультразвуком в течение 3 циклов по одной минуте каждый, амплитуда50%, в пульсовом режиме 1 с: 1 с (Branson Sonifier 450, США). Клеточный лизат- 44 -центрифугировали при 100000 g (ротор Ti45, Beckman-Coulter) в течение 1 часа инаносили на предварительно уравновешенную амилозную смолу (NEB, США).Колонку промывали десятикратным объемом буфера для лизиса и, затем, 10кратным объемом буфера, не содержащим Triton X-100.
Очищенные белкиэлюировали с колонки (50 мМ Трис-HCl pH=8,0, 150 мМ NaCl, 10 мМ Dмальтоза).Измерениеконцентрациивыделенныхбелковосуществляликолориметрически по методу с бицинхониновой кислотой BCA protein assay kit(Pierce, США). Чистоту выделения белковых препаратов анализировали путемэлектрофореза в ПААГ геле с последующей окраской коллоидным красителемКумасси R-250 (EZ Blue, Sigma-Aldrich, Германия).Для кристаллизационных экспериментов белок слияния MBP-Atxn3-Cдополнительно очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии наколонке Superdex 75 16/600 (GE Healthcare, США) с помощью FPLC-системы AktaPurifier(Akta,Швеция).КонечнаяконцентрацияMBP-Atxn3-Cдлякристаллизационных экспериментов составляла 10 мг/мл.2.2.2 Экспрессия и очистка белков в бакуловирусной системе экспрессииПолучение рекомбинантных бакмид.
Для получения рекомбинантногобакуловируса использовалась система Bac-to-Bac (Thermo Fisher, США).Рекомбинантные бакмиды (бакуловирусные челночные вектора bMON14272, 136т.п.н.), содержащие ген-вставку 6-His-S1R получали путем рекомбинации вклетках E.coli штамма DH10Bac (Thermo Scientific, США). Для этого клеткитрансформироваливекторомpFastBac-6His-S1Rикультивировалинаагаризованной среде LB, содержащей антибиотики канамицин (50 мкг/мл),тетрациклин (10 мкг/мл) и гентамицин (7 мкг/мл), а также IPTG (100 мкг/мл), Xgal(200 мкг/мл)втечение48-72часовпри37 °С.рекомбинантные бакмиды, не могли метаболизироватьКлетки,несущиеX-gal вследствиеинактивации бета-галактозидазы и образовывали «белые» колонии. «Белые»колонии пересеивались на агаризованную среду.
Из отдельных клоноввыделялись рекомбинантные бакмиды с помощью коммерческого набора для- 45 -выделения пДНК Wizard Plus Miniprep (Promega, США). Бакмидную ДНКосаждали изопропанолом и ресуспендировали в 10 мМ Трис-HCl pH=7,0. Наличиевставки интереса проверяли с помощью ПЦР с помощью пары праймеров М13(прямой 5’ GTAAAACGACGGCCAG; обратный 5’ CAGGAAACAGCTATGAC).Получение рекомбинантного бакуловируса и экспрессия белка. В работе дляэкспрессии целевого белка использовался вирус множественного ядерногополиэдроза AcMNPV, в котором экспрессия рекомбинантного белка находиласьподконтролемсильногополиэдриновогопромотора.Дляполучениярекомбинантного бакуловируса клетки Spodoptera frugiperda Sf9 рассеивались(1x106 кл/мл) в 6-луночные культуральные планшеты в бессывороточной среде Sf900 II SFM (Thermo Scientific, США) и культивировались в течение часа часа при27 °С для закрепления клеток на пластике.
Клетки трансфецировали полученнымибакмидами с помощью реагента для трансфеции CellFectin II (Invitrogen, США)согласно рекомендациям производителя. Спустя 4 часа после трансфекции средузаменяли и культивировали клетки в течение 3-7 дней при 27 °С до появленияпризнаков заражения и лизиса клеток (остановка роста, увеличенные клетки,содержащие полиэдроны, образование участков лизиса в монослое). Такимобразом, получали вирус низкого титра P1.Культуральную среду собирали, фильтровали через 0,45 мкм фильтр иинфицировали 10 мл суспензионной культуры клеток Sf9 1:50 разведением вирусаP1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
