Диссертация (1144259), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Две кристаллические структуры показали, что полиГ трактнаходится в двух конформациях: свободной петли и альфа-спирали. Без сомнения,посколькудифракционнаякартинаявляетсявремя-ипространственно-усредненным отображением внутренней структуры кристалла, нельзя отрицатьналичия переходных состояний между этими двумя вторичными структурами.Это согласуется с ранее полученными структурами первого экзона хантингтина,где было показано, что полиГ тракт способен принимать целый спектр различныхпереходных структур (рис.
25). Однако, в кристаллах атаксина-3, в силуособенностей кристаллической упаковки молекул, стало возможным независимоеопределение двух вторичным структур, что позволило уточнить особенностивторичной организации полиГ тракта. Область, следующая за полиГ трактом, повидимому, является разупорядоченной, что о чем свидетельствует отсутствиехорошо различимой электронной плотности в соответствующей областиэлементарной ячейки кристалла.4.1.2 Структура полиГ тракта атаксина-3: сравнение с другимиструктурами полиглутаминаВ предыдущих структурных исследованиях наблюдалась как альфаспиральная конформация, так и конформация случайной петли в областиполиглутаминового тракта хантингтина (PDB: 3IOR, 3IOT, 3IOU, 3IOV, 3IOW,3IO4, 3IO6 and 4FE8, 4FEB, 4FEC, 4FED) [54, 55]. Следует отметить, чтоструктуры хантингтина Htt-17Q и Htt-36Q были определены с более низкимразрешением в 3,6 Å и 3,0 Å, соответственно [54, 55].
Боковые цепиаминокислотных остатков глутамина не были достоверно определены вследствие- 101 -наличия множества конформаций в одном кристалле. Для разных кристаллов и впределах одного кристалла для разных молекул ассиметрической единицы полиГформировалальфа-спиральнуюаминокислотныхостатковструктуру(рис.25).длинойотКонформационнаяодногодо15гетерогенность,наблюдавшаяся для кристалла Htt, проявила себя как два типа кристаллов Atxn3С.
Наша гипотеза состоит в том, что полиглутаминовый тракт хантингтина иатаксина-3 находится в конформационном равновесии между альфа-спиральнойструктурой и структурой случайной петли. Эта гипотеза подтверждается рядомдругихструктурныхисследованийполиглутамин-содержащихпоследовательностей, где наблюдалось подобное равновесие [12, 29, 49, 112, 214,224-227].Рис. 25. Конформационная гетерогенность полиглутаминового тракта хантингтина(PDB 3IOR, 3IOT, 3IO4, 3IOW)В данной работе не может быть проигнорировано влияние соседнихмолекул MBP и возможные кристаллизационные артефакты.
Стабилизирующийэффект MBP на альфа-спиральную структуры может быть объяснен влияниемэффектарастворителяимежмолекулярнымивзаимодействиями.Вструктурированной области Q385-Q394 кристалла C2 MBP оказывает эффектэкранирования растворителя. MBP ограничивает поверхность полиГ, доступнуюдлярастворителя и, тем самым, благоприятствует внутримолекулярнымвзаимодействияммеждуостатками.Имеющиесянанастоящиймоментструктурные и биохимические данные согласуются с данными о том, что- 102 -полиглутамин может формировать альфа-спиральную структуру в отсутствиедополнительных спираль-стабилизирующих факторов.
Например, подобнаяальфа-спиральная конформация наблюдалась в кристаллической структурехантингтина в отсутствие взаимодействий с какой-либо другой частьюзакристаллизованного белка [54, 55]. Круговой дихроизм, методы молекулярногомоделирования и симуляции с помощью методов молекулярной динамики такжедемонстрируют наличие альфа-спиральной конформации для полиГ-повторов.Статистически, остатки глутамина имеют свойство часто обнаруживаться всоставе альфа-спиралей [226, 228-233].
Известно также, что боковые цепиглутамина могут формировать между собой водородные связи [231, 232].Недавнееисследованиепомоделированиюполиаланиновойспиралисинсерциями остатков глутамина является прямым доказательством наличия Q-Qсвязей в полиГ трактах [234]. Как альфа-спиральная, так и конформацияслучайной петли были обнаружены методами кругового дихроизма и с помощьюсайт-направленного мутагенеза рядом научных групп [29, 214, 233, 235].Конформационная стабилизация также наблюдалась в кристаллическойструктуре олигопептида 10Q в комплексе с анти-полиглутаминовым антителомMW1 [53].
В данной структуре пептид 10Q имеет развернутую конформацию ипрочно связан с антителом. Структуры апо-форм других анти-полиглутаминовыхантител указывают на то, что они узнают аналогичную вытянутую конформациюэпитопа [236]. Взаимодействия между полиглутаминовым пептидом и антителомвключают как взаимодействия между боковыми цепями, так и между атомамиполипептидного остова. Девять из десяти боковых цепей вовлечены вмежмолекулярные взаимодействия с антителом, и каждый из полипептидногоостова также взаимодействует с остатками паратопа, указывая на очень сильноевзаимодействие между антителом и антигенным пептидом [53].
Мы считаем, чтоантитело MW1 узнает лишь одну из возможных конформаций полиглутамина.Напротив, Atxn3-C формирует лишь небольшое число неспецифическихвзаимодействий с MBP, указывая на то, что стабилизационный эффект не стольвыражен в данном случае.- 103 -Внутримолекулярная стабилизация структуры полиГ была описана в рядетеоретических работ, но впервые наблюдалась нами экспериментально. В модели,предложенной Lathrop и коллегами, боковые остатки глутамина вовлечены вформирование межостаточных водородных связей между остатками i и i+4 [237].Установленная кристаллическая структура полиГ показывает, что остаткиглутамина способны формировать водородные связи как с i+4, так и с i+3остатками и наличие подобных взаимодействий приводит к разделениюпротяженных сетей водородных связей.
Кристаллическая структура глутаминбогатого домена HDAC4 также демонстрирует важность Q-Q взаимодействий какнастабильность спирали, так и на формирование спираль-спиральныхчетвертичныхструктур[238].Болеесовременноеисследованиепомоделированию полиГ находится в полном соответствии с представленнымиэкспериментальными данными [234]. При моделировании исследователями быливнесены остатки глутамина, регулярно расположенные на расстоянии i, i+4 вполиаланиновую модель альфа-спирали. Таким образом, был продемонстрированстабилизирующий эффект подобных аминокислотных замен, однако, в данномисследовании не было систематически исследовано влияние растворителя.4.1.3 Внутримолекулярные взаимодействия полиГ тракта атаксина-3Наиболее часто токсичность полиГ-удлиненных белков связывается спатологической макроагрегацией.
Ряд исследований, однако, указывает на то, чтокрупные белковые агрегаты сами по себе не являются токсичными [239-241]. Вряде работ показано, что часть патологических процессов в нейронах связана сабнормальными белок-белковыми взаимодействиями полиГ-удлиненных белков cвнутриклеточными белками-партнерами [82, 85, 86, 242].В кристаллической структуре кристалла С1 участок полиГ находится вобласти, доступной для растворителя и не формирует большого количестваконтактов с рядом расположенными остатками MBP. В кристалле C2 полиГспиральчастичноэкранированаотрастворителярасположеннымивнепосредственной близости молекулами MBP.
Остатки глутамина формируют- 104 -водородные связи с соседними молекулами MBP, в большинстве случаев, сзаряженными карбоксильными группами остатков аспарагиновой и глутаминовойкислоты, аминогруппами лизина и полярными группами остова полипептиднойцепи. Интересно, что протеомное исследование белков, взаимодействующих сполиГ-содержащими белками выявило преимущественное взаимодействие сбелками, богатыми заряженными аминокислотными остатками E, D и К [243].Остальные остатки полиГ были вовлечены в формирование внутримолекулярныхQ-Q водородных связей.Восемь из 14 остатков, формирующих полиГ тракт атаксина-3, участвуют вформировании прямых водородных связей с i+3 или i+4 остатками.
Остальныебоковые цепи полиГ (за исключением Q392) формируют водородные связи черезкоординированные молекулы воды. Полярный момент большинства остатковглутамина ориентирован параллельно оси альфа-спирали, как и формируемыемежостаточные водородные связи. Водородные атомы аминогрупп остатковглутамина являются донорными при формировании водородных связей, акислород карбоксигрупп является акцептором.
Однако, однозначная ориентацияостатков глутамина не может быть определена на картах электронной плотности,таким образом, ориентация Q-Q пар может быть изменена на 180° без ущерба дляформируемой сети водородных связей.Вцелом,резюмируяструктурныеособенностиопределеннойкристаллической структуры можно заключить, что остатки глутамина болеесклонны к гомотипическим Q-Q взаимодействиям, формируя большое количествомежостаточных водородных связей. Таким образом, полиГ участок в альфаспиральной конформации представляется инертным с точки зрения белокбелковых взаимодействий.4.1.4 Структура полиГ в контексте нейродегенеративных заболеванийМеханизм агрегации полиглутаминовых последовательностей не очевидениз данного структурного исследования, поскольку в настоящей работе былзакристаллизована последовательность непатогенной длины 14Q.
В ряде работ- 105 -былопредположено,чтополиглутаминовыепоследовательностимогутформировать спираль-спиральные структуры, что является первым этапомформирования полиглутаминовых агрегатов в нейронах [214, 244]. Интересно, чтопоследовательность,предположенакакфланкирующаяальфа-спиральная,полиглутаминовыйчтосогласуетсятракт,сбылаполученнымикристаллографическими данными [214]. Ряд исследований, объектами которыхбыли синтетические полиГ пептиды и первый экзон хантингтина показали, чтодля полиГ характерно равновесие между случайной конформацией и альфаспиралью (40-75% в зависимости от экспериментальных условий) [29, 214, 245], вто время как в данном рентгеноструктурном исследовании конформациисвободной петли и альфа-спирали наблюдались отдельно в двух различныхкристаллах.В кристаллической структуре первого экзона хантнгтина было показано, чтососедние фланкирующие последовательности могут оказывать влияние навторичную структуру полиГ тракта: домен N17 индуцирует альфа-спиральнуюконформацию в N-концевой области полиГ, в то время как полипролиновый тракт– конформацию полипролиновой спирали (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
