Диссертация (1144259), страница 21
Текст из файла (страница 21)
С помощью метода FRAP показано, что встраивание рецептора в холестеринсодержащие «гигантские» липосомы приводит к увеличению диффузии метки(увеличение коэффициента диффузии в 1,5 раза, p=0.055) что свидетельствует оS1R-опосредованном перераспределении холестерина в модельных мембранах7. С помощью методов флуоресцентной микроскопии и биохимическогофракционирования показано, что рецептор сигма-1 локализуется в особыхобластяхэндоплазматическогоаминокислотныхретикулума,CARC-последовательностей,чтообусловленосвязывающихналичиемхолестерин.- 118 -Мутации по критическим аминокислотным остаткам приводят к неправильномупозиционированию рецептора в клетке.8.
Сверхэкспрессия рецептора на клеточном уровне приводит к увеличениюконтактной длины между ЭР и митохондриями в клетках линии HEK293T.Функционально-активный рецептор необходим для поддержания нормальнойплотности синаптических контактов в гиппокампальных культурах нейронов invitro.- 119 -ЗАКЛЮЧЕНИЕВ настоящей работе с помощью спектра биофизических, структурных ифункциональных исследований был решен ряд фундаментальных проблем,касающихсяструктурнойорганизациибелков,вовлеченныхвразвитиенейродегенеративных заболеваний. С помощью метода рентгеноструктурногоанализа была определена структура С-концевой области атаксина-3, включающейполиГ тракт, с наиболее высоким доступным на настоящий момент разрешениемв 2 Å. Определенная вторичная структура подтвердила полученные ранееструктурные данные о белке хантингтине, а также предоставила новые данные овнутри- и межмолекулярных взаимодействиях полиГ тракта.
Из пептоиднойбиблиотеки было определено новое соединение HNP1, связывающиеся с аминоконцевой областью и обладающее антиагрегационными и нейропротекторнымисвойствами in vitro. С помощью оригинальных методик были исследованы белоклипидныевзаимодействиярецепторасигма-1человека.Впервыебылипредставлены экспериментальные биофизические данные в пользу того, чторецепторсигма-1являетсяосновным рафтовым организаторомлипидовэндоплазматического ретикулума, что позволило сформулировать гипотезу обелок-липид-белковом механизме функционирования рецептора сигма-1 черезстабилизацию липидных микродоменов.- 120 -СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙatxn – ataxin, атаксин (atxn3 – атаксин-3)bio – биотинBiP – binding immunoglobulin protein, белок связывания иммуноглобулиновDDM – додецил-β-D-мальтозидDIV – days in vitro, дней в культуреFRAP – fluorescent recovery after photobleaching, метод восстановленияфлуоресценции после фотовыжиганияGFP – green fluorescent protein, зеленый флуоресцентный белокHNP1 – huntingtin N17-binding peptoid 1, пептоид, связывающий N17Htt – huntingtin, хантингтинIP3R – инозитол-1,4,5-трифосфатные рецепторыJD – josephin domain, джозефин доменLd – liquid-disordered phase, жидко-разупорядоченная фазаLDAO – лаурилдиметиламиноксидLo – liquid-ordered phase, жидко-упорядоченная фазаMAM –mitochondria-associated membranes, митохондрий-ассоциированныемембраныN17 – N-концевой 17-аминокислотный домен хантингтинаNBD-ФХ –R/Rfree – R-фактор/«свободный» R-факторS1R – sigma-1 receptor, рецептор сигма-1So – solid-ordered phase, твердо-упорядоченная фазаUIM – uniquitin-interacting motif, убиквитин-связывающий доменА.к.о.
– аминокислотный остатковБХ – болезнь ХантингтонаГОЛ – «гигантские» одномембранные липосомы (англ. Giant unilamellar vesicles)ДОФХ – 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфохолин 18:1ДПФХ – 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин 16:0ККПП – коэффициент корреляции в прямом пространствеНДЗ – нейродегенеративные заболеванияполиГ – полиглутаминполиП – полипролинРСА – рентгеноструктурный анализСМ – сфингомиелиныСМА – спиномозжечковая атаксия (СМА 3 – спиномозжечковая атаксия 3-готипа)Т.п.н. – тысяч пар нуклеотидовФИ – фосфатидилинозитолыФХ – фосфатидилхолиныФЭ – фосфатидилэтаноламиныЭР – эндоплазматический ретикулум- 121 -БЛАГОДАРНОСТИВыражаюблагодарностьсвоимнаучнымруководителям:д.б.н.Безпрозванному Илье Борисовичу и д.н.
МиВи Ким за возможность работы надинтересным проектом, поддержку, обсуждения результатов, а также заорганизацию трех стажировок в Юго-западном медицинском центре университетаТехаса и поездок на конференции. Кульминской Анне Алексеевне запредоставление возможности работы в ПИЯФ НИЦ «КИ», за всевозможнуюпомощь в работе и написании диссертации. Власовой Ольге Леонардовне заобсуждения проекта и поддержку при написании диссертационной работы.Хотину Михаилу Георгиевичу и Большаковой Анастасии Викторовне заорганизациюзакупокоборудованияиреактивов.ПлотниковойПолинеВладимировне за помощь в решении административных вопросов.ВыражаюблагодарностьвсемсвоимколлегамполабораторииМолекулярной нейродегенерации СПбПУ и сотрудникам кафедры «Медицинскаяфизика», лаборатории Энзимологии ПИЯФ и лаборатории И.
Безпрозванного вЮго-Западном медицинском центре университета Техаса. В частности, асп.Светлане Корбан за помощь на протяжении выполнения проекта, асп. ПчицкойЕкатерине за обсуждения работы, асп. Нине Красковской и Dr. Daniel Ryskamp запомощь в выполнении работ на нейрональных культурах, Анне Старокадомскойза помощь в проведении экспериментов, а также сотрудникам лабораторииструктурной биологии в Юго-Западном медицинском центре университетаТехаса.Своей супруге Елене Васильевой за вдохновение, обсуждения и помощь воформлении работы, а также своим родителям Жемковой Любови Николаевне иКлыпе Евгении Васильевне за поддержку.ЗафинансовуюподдержкуработыавторвыражаетблагодарностьМинистерству образования и науки в рамках государственного задания(№17.991.2017/ПЧ, раздел работ 3.1.3-3.1.5, 3.2.3), Российскому научному фонду(№ 14-25-00024-П раздел работ 3.1.2-3.1.4, 3.3.6-3.3.8), грантам Национальных- 122 -институтов здоровья (R01 NS056224, 3.3.1-3.3.5; R01 NS080152 3.3.9-3.3.10),Национальному фонду атаксии (раздел работ 3.1.1), программе «УМНИК»(№7125ГУ/2015, раздел работ 3.2.1-3.2.2), программе «5-100-2020» (за стажировкии конференции), КНВШ Санкт-Петербурга.- 123 -ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ИССЛЕДОВАНИЯСтатьи1.
Zhemkov V.A., Kulminskaya A.A., Bezprozvanny I.B., Kim M. The 2.2Angstrom resolution crystal structure of the carboxy-terminal region of ataxin-3 //FEBS Open Bio. – 2016. – Т. 3(6). – С. 168-178. DOI: 10.1002/2211-5463.120292. Большакова А.В., Куканова Е.О., Гайнуллина А.Н., Жемков В.А., КорбанС.А.,БезпрозванныйИ.Б.Рецепторсигма-1какпотенциальнаяфармакологическая мишень при лечении нейропатологии // Научно- техническиеведомостиCанкт-Петербургскогогосударственногополитехническогоуниверситета. Физико-математические науки. – 2016. – Т.
1 (237). – С. 48-65. DOI:10.5862/JPM.237.5Материалы конференций3. Жемков В.А. Корбан С.А., , Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б.,Ким. Белок-липидные взаимодействия рецептора сигма-1 человека // XIX Зимняямолодежная школа по биофизике и молекулярной биологии ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ«Курчатовский институт». Сборник тезисов. – 2018. – С.4. C.А. Корбан, В.А. Жемков, А.А. Кульминская, И.Б.
Безпрозванный, М.В.Ким. Cигма-1 рецептор – новая мишень при нейропатологиях. Cтруктура ифункция // Acta Naturae, Спецвыпуск. Международная научная конференция побиоорганической химии «XII чтения памяти академика Юрия АнатольевичаОвчинникова» и VIII российский симпозиум «Белки и пептиды». М.:Издательство «Перо». –2017. – С. 113.5. Корбан С.А., Жемков В.А., Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б., КимМ.В. Лиганд-индуцированные структурные изменения сигма-1 рецепторачеловека. Корбан С.А., Жемков В.А., Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б., КимМ.В. // Неделя науки СПбПУ: Материалы научной конференции смеждународнымучастием.Институтфизики,нанотехнологийителекоммуникаций.
– 2017. – С. 473-476.6. Жемков В.А., Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б., Ким М.В..Исследование протекторного механизма анти-агрегационного хантингтинсвязывающего пептоида HNP1. Неделя Науки СПбПУ: Материалы научнойконференции с международным участием. Институт Физики, Нанотехнологий иТелекоммуникаций. – 2016. – С.
436-4377. Bolshakova A.V., Zhemkov V.A, Gainullina A.N., Kukanova E.O., KorbanS.A., I.B. Bezprozvanny. Sigma-1 Receptor is a Potential Drug Target forNeuropathology Treatment // Opera Medica at Physiologica – 2016. – Т. 2(S1). – С. 85868. Жемков В.А., Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б., Ким М.В.Особенности структурной организации полиглутаминового тракта белкаатаксина3 // Неделя Науки СПбПУ: Материалы научного форума с международным- 124 -участием. Институт Физики, Нанотехнологий и Телекоммуникаций. – 2015.
– С.435-436.9. Zhemkov V.A., Kulminskaya A.A., Bezprozvanny I.B., Kim M. Crystalstructure of the ataxin-3 carboxy terminal region. // Neurodegenerative diseases. – 2015.– T. 15(Suppl. 1). – C. 1659 ADPD5-0230.10. Жемков В.А., Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б., Ким М.В.Кристаллические структуры полиглутаминового тракта белка атаксина- 3 //Неделя Науки СПбПУ: Материалы научно-практической конференции. ИнститутФизики, Нанотехнологий и Телекоммуникаций СПбПУ. – 2015.
– С. 417-418.11. Жемков В.А., Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б., Ким М.В..Структурные особенности полиглутаминового тракта атаксина-3. // 5 СъездБиофизиков России. Материалы докладов. – 2015. – Т.1. – С. 8412. Корбан С.А., Жемков В.А., Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б.,Ким М.В. S-1 рецептор как новая терапевтическая цель при нейродегенеративныхзаболеваниях. Экспрессия, выделение и очистка s-1 рецептора человека дляструктурно-функциональных исследований // Неделя Науки СПбПУ: Материалынаучного форума с международным участием.
Институт Физики, Нанотехнологийи Телекоммуникаций. – 2015. – С. 444-445.13. Жемков В.А., Корбан С.А., Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б.,Ким М.В.. Гетерологическая экспрессия, выделение и очистка сигма-1 рецепторачеловека. // II Конференция молодых ученых и специалистов ПИЯФ. Сборникдокладов. – 2015. - С. 5414. Zhemkov V.A., Vali S., Kulminskaya A.A., Vlasova O.L., BezprozvannyI.B. and Kim M.W. Crystallization of Biotinylated Huntingtin N17 Domain withStreptavidins.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
