Диссертация (1144259), страница 17
Текст из файла (страница 17)
21).- 94 -Рис. 21. Внутриклеточная локализация рецептора дикого типа и мутантов по сайтусвязывания с холестерином. А. Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии дляопределения внутриклеточной локализации мутантных форм белка: RR (R7ER8E), deltaRR, 4G,WW (W9LW11L)по сравнению с рецептором дикого типаБ. Коэффициент колокализацииМандерса между каналами GFP и mCherry.Для каждой из конструкций был рассчитан коэффициент колокализацииМандерса Mc, что позволило количественно оценить влияние мутаций нараспределение рецептора в эндоплазматическом ретикулуме.
В результатеанализа, было показано, что мутанты R7ER8E, deltaRR и WW диффузнораспределены в тубулах ЭР (рис. 21 Б, рассчитанный коэффициент колокализациимежду каналом S1R-GFP и маркером ЭР mCherry-ER составил Mc=0.914, 0.923,для дикого типа, соответственно, Mc=0.55), в то время как для мутантов синсерциями наблюдалось частичное перераспределение рецептора в сторонутубул ЭР (Mc=0.84). Для мутанта WW в клетках с высоким уровнемсверхэкспрессии также наблюдалась агрегация мутантного белка.Таким образом, полученные результаты позволили доказать наличиепрямого сайта узнавания холестерина в составе трансмембранного участкарецептора сигма-1.- 95 -3.3.8 Рецептор сигма-1 человека локализуется в составе мембран ЭР,ассоциированных с митохондриямиНаследующемфракционированиевнутриклеточногоотделеныотэтапеорганеллработысраспределениямикросомальнойцентрифугирования,абылоцельюосуществленоболеерецепторафракциисдетальнойсигма-1.биохимическоехарактеристикиМитохондриипомощьюбылидифференциальногомитохондрия-ассоциированныемембраныотмитохондрий – с помощью центрифугирования в градиенте перколла.
Фракциианализировали с помощью Вестерн-блот анализа с последующей окраскойантителамипротивсоответствующихмаркерныхбелковорганелл.Дляопределения внутриклеточной локализации эндогенного S1R было осуществленофракционирование мембран, выделенных из печени мышей (рис. 22 А).Эндогенный рецептор обнаруживался во фракции МАМ, но не в тубулярном ЭР(микросомальная фракция).Для оценки влияния мутации RR в сайте связывания с холестерином налокализациюрецептора,конструкциидикогоимутантноготипабылисверхэкспрессированы в клетках линии HEK293T. Для вычисления соотношенияраспределения рецептора сигма-1 между МАМ и ЭР количество белка на каждойдорожке определяли денситометрически, после чего нормализовали на уровеньбелка STIM1 - трансмембранного белка ЭР, не обогащенного во фракции МАМ.Было показано, что сверхэкспрессированный белок дикого типа преимущественнолокализуется,какиэндогенныйрецептор,всоставемембранЭР,ассоциированных с митохондриями (соотношение МАМ:ЭР=8), в то время как втубулярном ЭР присутствует лишь небольшая часть рецептора (рис.
22 Б).Окраска против рецептора инозитол-1,4,5-трифосфатного рецептора 3-го типа(IP3R3) осуществлялась для контроля чистоты выделения фракции МАМ. Всогласии с вышеописанными данными иммунофлуоресцентного анализа, мутантпо сайту связывания холестерина в равных количествах обнаруживается как вмитохондрий-ассоциированных мембранах, так и в тубулярном ЭР (соотношениеМАМ:ЭР=1).Наоснованиибиохимическихданныхиданных- 96 -иммунофлуоресцентноймикроскопииможноутверждать,чтоS1Rпреимущественно находится в местах ассоциации ЭР с митохондриями. Тем неменее, существует вероятность нахождения рецептора в других обогащенныххолестериноммембранах,которыевданнойработебиохимическинеизолировались.Рис.
22. Биохимическое фракционирование органелл для подтверждения локализациирецептора сигма-1 и мутантной формы R7ER8E. А. Вестерн-блот анализ послефракционирования мембран печени мыши. Выделенные фракции отмечены следующимобразом: лизат – общий клеточный лизат, мит.
(общ.) – неочищенные митохондрии, мит.(очищ.) – очищенные в градиенте перколла митохондрии, МАМ –ассоциированные смитохондриями мембраны, микросомы – ЭР, цитозоль. Маркерные белки: CRT –кальретикулин (МАМ-маркер), tubulin – тубулин (цитоплазматический маркер), S1R – рецепторсигма-1, TOM20 – митохондриальный рецептор импорта, субъедицина 20 (маркермитохондрий).
Б. Вестерн-блот анализ после фракционирования мембран клеток HEK293T,сверхэкспрессирующих S1R. . Выделенные фракции отмечены следующим образом: мит. (общ.)– неочищенные митохондрии, мит. (очищ.) – очищенные в градиенте перколла митохондрии,МАМ – ассоциированные с митохондриями мембраны, цитозоль.микросомы – ЭР. Маркерныебелки: IP3R3 – инозитол-1,4,5-трифосфатный рецептор тип 3 (маркер МАМ), STIM1 – stromalinteraction molecule 1 (маркер ЭР), tubulin – тубулин (цитоплазматический маркер), S1R –рецептор сигма-1, TOM20 - митохондриальный рецептор импорта, субъедицина 20 (маркермитохондрий). WT – фракции, полученные из клеток, сверхэкспрессирующих рецептор дикоготипа, RR – соответствующий мутант. В.
Количественный анализ вестерн-блота на рис. Б.Таким образом, с помощью двух взаимодополняющих методов, а именноиммунофлуоресцентной микроскопии и биохимического фракционированиямембран было показано, что рецептор дикого типа локализуется в составемембран, ассоциированных с митохондриями.
Мутации в идентифицированномсайте связывания холестерина приводили к неправильной локализации рецептора- 97 -и перераспределению белка из фракции МАМ в тубулы эндоплазматическогоретикулума. Вероятно, именно белок-липидные взаимодействия могут игратьважную физиологическую роль в нормальном функционировании рецепторасигма-1.3.3.9 Сверхэкспрессия рецептора сигма-1 на клеточном уровне приводит кувеличению контактной длины между ЭР и митохондриямиВышеописанные результаты свидетельствуют в пользу того, что рецепторсигма-1 является важным белком-организатором липидных микродоменов,связываясь с холестерином и сфингомиелинами и, тем самым, модулируясвойства окружающего липидного бислоя.Физиологическое значение S1R-опосредованной стабилизации липидныхрафтов было изучено с помощью просвечивающей электронной микроскопииклеток, сверхэкспрессирующих маркированный белок слияния S1R-APEX2, посравнению с контрольными клетками, трансфецированных маркером HRP-ER дляокраски ЭР.
Был подсчитан процент митохондрий, формирующих контакты с ЭР,а также средняя длина контакта (рис. 23). Было показано, что сверхэкспрессияS1R на ультраструктурном уровне приводит, в среднем, к увеличению контактнойдлины, что видно на гистограмме распределения в зависимости от длиныконтакта в клетках, сверхэкспрессирующих рецептор S1R .Рис. 23.
Результаты просвечивающей электронной микроскопии по измерениюконтактной длины между ЭР и митохондриями. А и Б – контрольные клетки,трансфецированные маркерным белком HRP-ER и S1R-APEX2, соответственно. МАМобозначены белыми стрелками. В. Гистограмма распределения длин контактов в контрольныхклетках (control) и клетках, сверхэспрессирующих S1R (S1R o/e).- 98 -3.3.10 Функционально активный рецептор сигма-1 необходим дляподдержания синаптических контактов в первичных гиппокампальныхкультурах нейронов in vitroВ заключение, был проверен эффект влияния сверхэкспрессии рецепторадикого типа и мутанта R7ER8E на способность образовывать синаптическиеконтакты в первичной культуре нейронов, полученных от мышей дикого типа имышей, нокаутных по гену S1R (рис. 24).
Первичные нейрональные культурыбыли трансфецированы флуоресцентным маркером tdTomato и инфицированылентивирусами, содержащими ген-вставку рецептора сигма-1 дикого типа илимутанта RR. Культуры были зафиксированы на 14 день культивирования (DIV 14)и визуализированы с помощью конфокального микроскопа. Идентификация иклассификация синаптических контактов (дендритных шипиков) проводились впрограмме NeuronStudio.Было показано, что сверхэкспрессия рецептора дикого типа не приводит кизменениюпроцентагрибовидныхшипиковвнейрональнойкультуре,полученной от мышей дикого типа. Считается, что грибовидные шипикипредставляют собой зрелые функционально-активные синаптические контакты.Приэтомсверхэкспрессиябелка,мутантногопосайтусвязываниясхолестерином, приводила к уменьшению количества грибовидных шипиков, чтосвидетельствует о доминант-негативном влиянии R7ER8E.В нейронах, полученных от мышей, нокаутных по гену сигма-1 рецепторанаблюдалосьстатистически-значимоеуменьшениепроцентагрибовидныхшипиков по сравнению с культурами, полученными от мышей дикого типа.
Этосогласуется с ранее полученными в нашей лаборатории данными о том, чтонокаутирование гена SIGMAR1 приводит к потере синаптических контактов вмодельной кортико-стриатальной культуре нейронов [145]. Сверхэкспрессиярецептора дикого типа позволила полностью восстановить утраченную функцию,в отличие от сверхэкспрессии мутантного белка. Это свидетельствует о том, чтона нейрональном уровне мутант по сайту связывания холестерина R7ER8E неможет восполнить нормальную функцию белка.- 99 -Рис.
24. Влияние рецептора дикого типа и мутанта R7ER8E на формированиесинаптических контактов в культурах нейронов in vitro. Слева: сверхэкспрессия мутантногобелка приводит к потере шипиков. Справа: мутант не может компенсировать отсуствиефункции S1R в клетках, полученных от мышей, нокаутных по гену S1R (S1RKO).- 100 -Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ4.1 Кристаллическая структура С-концевой области атаксина-34.1.1 Общая характеристика кристаллической структуры С-концевогофрагмента атаксина-3В данном исследовании была определена кристаллическая структура Сконцевого участка атаксина-3 с наиболее высоким на настоящий моментразрешением в 2.2 Å.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
