Диссертация (1144259), страница 14
Текст из файла (страница 14)
10. Валидация кристаллической структуры полиГ альфа-спирали в кристалле С2. А.Стереоизображения модели структуры полиГ тракта и соответствующие карты электроннойплотности. 2Fo-Fc карта электронной плотности показана фиолетовым цветом. ИсключеннаяOMIT карта электронной плотности (боковые цепи а.к.о. были исключены) показана чернымцветом (пороги отсечки 0.9 σ).
Б. Черная и зеленая кривые – абсолютное значение электроннойплотности в области Atxn3-C. Синяя кривая представляет собой значение локальногокоэффициента корреляции в прямом пространстве (синяя линия – уровень 0,85). Красная криваяпоказывает поостаточные тепловые B-факторы остатков в регионе Atxn3-C (красная линия –уровень 1,5 Bср).3.1.5 ЗаключениеВданнойчастиработысприменениемметодарентгеновскойкристаллографии были определены структуры полиГ тракта атксина-3 в двухразличных кристаллах. Было показано, что полиГ может находиться в двухразличных конформациях: свободной петли и альфа-спирали.
Наличие двух- 75 -конформаций полиГ согласуется с предыдущими структурными исследованиямиполиГ тракта хантингтина. Анализ полиГ спирали атаксина-3 показал наличиевнутриспиральных водородных связей между боковыми цепями остатковглутамина. Подобные межостаточные взаимодействия ранее были теоретическипредположены для альфа- и бета-структур полиГ участков, но впервыенаблюдались нами экспериментально. Структурная информация, полученная врезультатеанализаучасткаатаксина-3позволяетпредположить,чтовнутриспиральные водородные связи, формируемые между остатками глутамина,приводяткагрегациимакроагрегации в нейронах.полиГ-содержащихбелков,ипатологической- 76 -3.2 Нейропротекторные свойства пептоида HNP13.2.1 Идентификация пептоида HNP1 из многомерной пептоиднойбиблиотеки в качестве лиганда для амино-концевого участка хантингтинаN17Для идентификации пептоидов, специфично связывающихся с N-концевымучастком хантингтина N17, была синтезирована первичная 6-мерная пептоиднаябиблиотека, насчитывающая 59049 соединений (рис.
11 А). Пептоиды былисинтезированы на носителе TentaGel. Каждый этап химического синтеза включалреакцию ацилирования и нуклеофильного замещения первичным амином (Глава2. Материалы и методы). Особенностью библиотеки являлось то, что на каждомшарике содержалось несколько молекул одного и того же уникальногосоединения.
Общая структура библиотеки пептоидных соединений приведена нарис. 5 А.Рис. 11. Химические структуры пептоидной библиотеки (А) и пептоида HNP1 (Б)В общей структуре библиотеки остаток пролина был фиксирован в 4-мположении, в то время как остальные пять позиций были случайными. Присинтезе пептоидной библиотеки были использованы следующие первичныеамины:1,4-диаминобутан,изобутиламин,этаноламин,(R)-метилбензиламин,триптамин,аллиламин,пиперониламин,фурфуриламин,- 77 -метоксиэтиленамин (табл. 3). Данные первичные амины были использованы намиранее при синтезе пептоидного соединение HQP09 [122].Для идентификации соединений, связывающихся с целевым участкомхантингтина, использовался биотинилированный (bio) N-концевой пептидхантингтинаbio-N20,последовательность:имеющийследующуюbio-MATLEKLMKAFESLKSFQQQ.аминокислотнуюИдентификацияпептоидов основывалась на той особенности библиотеки, что один шарикносителясодержалодноуникальноепептоидноесоединение.Bio-N20детектировался с помощью стрептавидина, меченого квантовыми точками Qdot555.
Шарики, с которыми связался целевой участок хантингтина, при скрининге спомощью флуоресцентного микроскопа выглядят окруженными красной каймой.Голубые шарики, имеющие красную кайму квантовых точек, отбирались вручнуюпри визуальном контроле в микроскоп и использовались для идентификациипоследовательности пептоидов (рис. 12 А). Каждый индивидуальный шарик,характеризующийся красной каймой, был секвенирован по методу Эдмана дляопределения последовательностей пептоидов. Индивидуальные пептоидныесоединения для дальнейших исследований были синтезированы на шарикахносителя, следуя такому же протоколу, как описано при синтезе первичнойпептоидной библиотеки. Одним из таких соединений был пептоид, названныйHNP1 (huntingtin N17-binding peptoid 1, химическая структура которого приведенана рис.
11 Б).Для дальнейших исследований пептоид HNP1 и пептоид со случайнойхимической последовательностью (RP02) были ре-синтезированы. Ранее былопоказано, что полиГ-удлиненный (n>36) первый экзон хантингтина пригетерологической экспрессии агрегирует, что может помешать на этапескрининга. Чтобы избежать этих трудностей, нами были получены белки слиянияпервого экзона хантингтина с мальтозо-связывающим белком MBP, так как впредыдущих исследованиях нами было показано, что белок слияния не агрегируетв растворе даже при наличии удлиненного полиГ участка [122]. Длядемонстрации того, что соединение специфично связывается с целевой областью- 78 -белка-мишени N17, были проведены следующие эксперименты.
Шарики HNP1инкубировались с MBP-Htt-17Q, MBP-Htt-45Q, и белком MBP. Связанные белкидетектировались моноклональными антителами против MBP и меченымквантовыми точками вторичными анти-мышиными иммуноглобулинами. В этихэкспериментах было подтверждено, что HNP1 связывается с MBP-Htt-17Q и -45Q,но не связывается MBP (рис. 12 А). Также можно заключить, что связываниеHNP1 было более сильным с рекомбинантным MBP-Htt-45Q по сравнению сMBP-Htt-17Q.КонстантадиссоциациипептоидаHNP1иN-концевойобластихантингтина N17 была определена с помощью метода изотермическойтитрационной калориметрии (ITC) на приборе NANO ITC (TA Instruments).
Вданном эксперименте после каждого введения HNP1 измерялось количествотеплоты (ΔH), выделяемой во времени (рис. 12 Б). Кривая связывания былаполучена путем построения зависимости ΔH каждого введения от отношенияконцентраций лиганда (HNP1) и белка (MBP-Htt-17Q) в ячейке. Анализполученных результатов показал, что Kd связывания HNP1 и MBP-Htt-17Qнаходится в пределах 20-30 мкМ. В контрольных экспериментах с RP02пептоидом наблюдался только сигнал, обусловленный растворением белка вячейке при добавлении лиганда.Рис. 12 Идентификация соединений, специфически связывающихся с амино-концевойобластью хантингтина. А.
Флуоресцентная микрофотография, демонстрирующая связывание- 79 флуоресцентно-меченого амино-концевого участка хантингтина N17 с шариками носителя,содержащими уникальные пептоидные соединения (в частности, пептоид HNP1). В качествеотрицательного контроля приведена микрофотография, на которой видно отсутствиесвязывания хантингтина с пептоидом со случайной последовательностью (RP2).Б. Результаты изотермической титрационной калориметрии для определения константысвязывания HNP1. Вверху: данные, полученные в эксперименте по титрационнойкалориметрии. Внизу: изотерма связывания, построенная в предположении одного сайтасвязывания.3.2.3 N17-связывающий пептоид HNP1 ингибирует агрегацию мутантногохантингтина в клеточной модели in vitroИзвестно, что мутантные белки с удлиненным полиглутаминовым трактомсклонны к формированию цитоплазматических и ядерных агрегатов, что являетсяодной из причин их цитотоксичности.
В следующих экспериментах былиохарактеризованы анти-агрегационные свойства синтезированного пептоидногосоединения HNP1. Для количественного измерения агрегации мутантногохантингтина in vitro, был получен ряд генетических конструкций, кодирующихфлуоресцентные белки слияния Htt-nQ-GFP (n=17, 48, 82, 138) для экспрессии вклеточной линии HEK293T. Клетки HEK293T культивировались на предметныхстеклах, после чего были трансфецированы векторами Htt-nQ-GFP.
В каждомнезависимом эксперименте было проанализировано по 20 полей зрения, в каждомиз которых подсчитывалось общее количество GFP-позитивных клеток и клеток,имеющих цитоплазматические или ядерные включения хантингтина. Такимобразом, было вычислено процентное соотношение клеток, содержащихвнутриклеточные агрегаты. В предварительных экспериментах было показано,что после экспрессии белков в течение 72 часов Htt-17Q-GFP не формируетядерных и цитоплазматических агрегатов, Htt-48Q-GFP агрегаты обнаруживалисьв небольшой фракции клеток, в то время как агрегаты Htt-138Q-GFPобнаруживались практически в каждой GFP-позитивной клетке (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
