Диссертация (1144259), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Детергентудаляли путем адсорбции на гидрофобной смоле BioBeads SM-2 (20:1 в/всмола:детегент,трижды,BioRad,США).Полученныелипидно-белковыемембраны очищались путем центрифугирования на 5-60% градиенте сахарозы(50 мМ HEPES pH=8,0, 200 мМ NaCl ) при 10000 g в течение 2 часов (роток SW55,Beckman-Coulter). Протеолипосомы переосаждали (100000 g, 1 час, роток Ti100Beckman-Coulter), ресуспендировали в бессолевом буфере (20 мМ HEPES pH=8,0)и использовали для получения «гигантских» одномембранных липосом.2.7.3 Получение «гигантских» одномембранных липосом (ГОЛ)Для получения ГОЛ протеолипосомы (объемом не более 0,5 мкл) помещалина предметные стекла, покрытые тонким слоем высушенной 1% агарозы ивысушивали при комнатной температуре в течение 20 минут.
Пленкирегидрировали в солевом буфере (25 мМ HEPES pH=8,0, 150 мМ NaCl, 200 мМсахароза) при 42 °С в течение часа, что приводило к формированию и росту ГОЛ.Для изучения белковой локализации ГОЛ визуализировали с помощью лазерногосканирующего конфокального микроскопа Leica.2.7.4. Измерение коэффициентов диффузии мембранных липидовДля измерения коэффициентов диффузии мембранных липидов в ГОЛиспользовалсяметодвосстановленияфлуоресценциипослевыжигания(fluorescent recovery after photobleaching, FRAP). Для этого небольшой участокмембраны ГОЛ выжигался коротким высокоинтенсивным лазерным импульсом(0,1 с) и восстановление флуоресценции в области наблюдалось через временныеинтервалы 0,1 с.
Полученную зависимость аппроксимировали экспоненциальной- 62 -f (t ) A(1 exp(1/2t )) Для вычисления коэффициентов диффузиифункциейметки D пользовались формулой для двумерной диффузии:1/2 R2 / 4 DВ каждом эксперименте измерялось не менее 10 липосом d>10 мкм.2.8 Электронная микроскопияДля изучения контактов между ЭР и митохондриями клетки линииHEK293T культивировали на стеклах и трансфецировали следующими векторами:HRP-ER для экспрессии белка-пероксидазы HRP в тубулах ЭР и S1R-APEX2 дляэкспрессии рецептора, слитого с пероксидазой APEX2.
Клетки фиксировали в 2%растворе глутарового альдегида (Electron Microscopy Sciences, США) иинкубировали с веществом для контрастированияDAB (диаминобензинтетрахлорид, Sigma-Aldrich, США). Полимеризацию DAB осуществляли путемдобавленияпероксидаводорода(100 мМ)втечение10 минут.Клеткиподготавливали для электронной микроскопии согласно стандартным методикам.Вторичную фиксацию осуществляли 2% раствором уранил-ацетата (ElectronMicroscopy Sciences, США) в течение 1 часа.
Первичное окрашивание проводилис помощью тетроксида осмия. Клетки дегидрировали с помощью промывок вспиртосодердащих растворах (10-100%) и заключали в смолу Epon-812 (ElectronMicroscopy Sciences, США). Заключенные клетки нарезали на тонкие среды спомощью ультрамикротома Leica и вторично окрашивали цитратом свинца.Изображения получали с помощью просвечиващего электронного микроскопаJEOL 1200 EX (JEOL, Япония) при напряжении на трубке 120 кВ.2.9 Статистические тесты оценки достоверностиСцельюанализастатистическизначимыхразличийэкспериментальными группами, использовался t-критерией Стьюдента.между- 63 -ГЛАВА 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ3.1 Кристаллическая структура С-концевого фрагментабелка атаксина-33.1.1 Выделение, очистка и кристаллизация белка слияния MBP-Atxn3-CВ данной работе исследования были сосредоточены на установленииструктурыкарбоки-концевогоучасткаспомощьюрентгеновскойкристаллографии. В работе была установлена кристаллическая структура Сконцевого участка атаксина-3, содержащего полиглутаминовый тракт (полиГ)длиной 14 а.к.о.Длякристаллизациикарбокси-концевогоучасткаатаксина-3былиспользован подход, который до этого позволил нам определить структурупервого экзона хантингтина [54, 55].
Для этого последовательность, кодирующаяAtxn3-C(а.к.последовательностьS278-D329)былаклонированавэкспрессионный вектор pMAL для экспрессии белка слияния с мальтозосвязывающим белком MBP. Аминокислотная последовательность белка слиянияпоказана на рис. 2 А. В данной работе был исследован белок, содержащий полиГтракт непатогенной длины. Последовательность тракта из 13Г и одного лизинаявляется одним из наиболее часто встречаемых вариантов у здоровых людей [209211].
Ряд исследований показал важность последовательностей, фланкирующихполиглутамин, их влияние на структуру полиГ, его функцию и токсичность [5,110, 113, 212, 213]. С учетом этого, в данной работе С-концевой фрагмент былзакристаллизован в своем нативном белковом контексте. Atxn3-C начинается состатка серина S278, остатка, предшествующему С-концевой фланкирующейпоследовательности [214]. Аминокислотный остаток D329 находится передмотивом UIM3, структура которого была ранее определена [11].
Как и в работе покристаллизации первого экзона хантнгтина, с С-концевого конца химерного белкабыладобавлена19-аминокислотнаяпоследовательностьQSYQITAGKLGTGRRFTTS [54, 55]. На карте электронной плотности структура- 64 -С-концевого тага не была определена, тем не менее, лишь конструкции,содержащие С-концевой таг, позволили получить белковые кристаллы.MBP-Atxn3 был экспрессирован в клетках E. coli штамма BL21(DE3),выделен и очищен с помощью аффинной хроматографии на амилозной смоле ипоследующей гель-фильтрации на хроматографической колонке Superdex7516/600.
Чистота выделения белкового препарата составляла более 95% приокраске Кумасси (рис. 6).Рис.6 . Выделение MBP-Atxn3-C и дифракционные качества полученных кристаллов. А.Анализ выделенного на амилозной смоле рекомбинантного белка MBP-Atxn3-C с помощьюПААГ (окраска Кумасси). Б. Профиль гель-фильтрации очищенного белка MBP-Atxn3-C. В.Дифракционная картина кристалла MBP-Atxn3-C (кристалл C1).Скринингусловийкристаллизациипроводился,опираясьнаидентифицированные ранее условия кристаллизации MBP-Htt-Ex1 [54, 55].Кристаллы были получены с помощью метода диффузии водяных паров вмодификацииисследования«висячаяпоказаликапля».Посколькуналичиепредыдущиеконформационнойструктурныегетерогенностиполиглутаминового тракта в кристаллах первого экзона хантингтина, мыпостарались различные кристаллические формы для белка слияния MBP-Atxn3-C.Так, в данной работе кристаллы MBP-Atxn3-C были получены в двух формах:призматической (C1, тетрагональная сингония) и пирамидальной (C2, триклиннаясингония).
Условия кристаллизации были оптимизированы с целью получениякристаллов с наилучшими дифракционными качествами. Условия кристаллизацииприведены в главе Материалы и методы.- 65 -Полный набор дифракционных данных для двух кристаллов был получен насинхротронном источнике APS, линия 19ID (Advanced Photon Source, Аргонн,США). Дифракционный предел для обоих исследованных кристаллов составлялпорядка 2 Å, однако, параметры элементарной ячейки были различными (табл. 1).Первичнуюмаксимумов,обработкудифрактограммопределениеинтегральной(индексированиеинтенсивностидифракционныхишкалирование)проводили в программе HKL2000.3.1.2. Построение и уточнение кристаллической структурыMBP-Atxn3-CПослеполучениямассиваданных,содержащегоинтенсивностидифракционных максимумов, фазы структурных факторов были определены спомощью метода молекулярного замещения.
В качестве поисковой моделииспользовалась структура MBP 1ANF из базы данных PDB. Определение фазпроводилось в программе Phaser [188].Построение и корректировка модели проводилась вручную в программеCoot [191]. Разрешение карты электронной плотности было хорошим в областиMBP, в то время как изначальная карта в области Atxn3-C была более низкогокачества. По мере построения и уточнения модели электронная плотность вобласти Atxn3-C становилась более очевидной.
На промежуточном этапепостроения модели были добавлены молекулы координированной воды. Модельперестраивалась и уточнялась (в программе Refmac5 [195]) до получениямаксимально достижимого соответствия с экспериментальным набором данных,ориентируясь на кристаллографические параметры R и Rfree. Помимо этого,контролировались среднеквадратичные отклонения длин связей и углов.
Остатки,для которых боковые цепи а.к.о. не могли быть построены достоверно ввидуотсутствияэлектроннойротамерные конформации.плотности,строилиськакнаиболеевероятные- 66 -Финальные координаты двух структур, построенных на основании массивовдифракционных данных для кристаллов C1 (4YS9) и C2 (4WTH) были приняты идепонированы в базу данных белковых структур PDB.3.1.3 Кристаллическая структура карбокси-концевого участка атаксина-3(Atxn3-C)При анализе кристаллической упаковки молекул было обнаружено, чтоупаковка молекул в кристаллах C1 и C2 также была различной (рис. 7 А и Б). Так,в ассиметричной единице кристалла C1 содержалась одна молекула белка, в товремя как в кристалле С2 содержались две молекулы в ассиметричной единице.Кристаллографические данные и статистика уточнения кристаллических структурдля кристаллов C1 и С2 приведены в табл.
1.Рис. 7 Упаковка молекул в кристаллах C1 и C2 MBP-Atxn3-C. А. Упаковка молекул вкристалле С1. Б. Упаковка молекул в кристалле С2.А.к. последовательность MBP показанасерым, N-концевая фланкирующая последовательность – зеленым, полиГ тракт – оранжевым,С-концевая фланкирующая последовательность – синим, С-концевая последовательность,добавленная для кристаллизации – желтым цветами. Б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
