Диссертация (1144259), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Уточнениепроводили в программе Refmac 5 [194, 195], расчет геометрии структуры впрограмме MOLPROBITY и phenix.refine [196, 197]. Молекулярные поверхностивзаимодействия анализировали в программе PISA [198]. OMIT-карты электроннойплотности и расчет коэффициента корреляции в прямом пространстве былииспользованы для валидации полученной модели. Тепловые B-факторы а.к.о.рассчитывали в программном пакете CCP4 [199], параметры водородных связейанализировали в программе HBOND [200], присвоение вторичной структуры поалгоритму DSSP [194, 201]. Модель была визуализирована в программной средеPyMol [202].2.3.3 Валидация структуры полиГ тракта атаксина-3Коэффициент корреляции в прямом пространстве (ККПП) для каждогоостатка (i) рассчитывался по следующей формуле: (ρ(x, y,z)obs,i - ρ(x, y,z)obs,i )× (ρ(x, y,z)obs,i - ρ(x, y,z)obs,i )ККППi =x,y,zx,y,z2( (ρ(x, y,z)obs,i - ρ(x, y,z)obs,i ) × (ρ(x, y,z)obs,i - ρ(x, y,z)obs,ix,y,z2) )1/ 2- (7),x,y,zгде obs,i ( x, y, z ) - экспериментальное значение электронной плотности для i-гоостатка в точке x,y,z (рассчитанное по формуле (1) с использованиемэкспериментально определенных амплитуд структурных факторов и фаз модели);- 52 calc,i ( x, y, z ) -рассчетное значение электронной плотности для i-го остатка в точкеx,y,z с использованием рассчитанных амплитуд структурных факторов и фазмодели.
Локальный КППП был рассчитан в программе phenix.map_to_model [203].Поостаточный ККПП позволяет оценить качество построенной модели иопределить остатки, построенные с высокой и низкой степенью достоверности.Обычно, считается, что для хорошей модели ККПП составляет более 0,85-0,90.2.4 Идентификация пептоида HNP12.4.1 Синтез пептоидной библиотекиДля синтеза пептоидной библиотеки был применен комбинаторный метод«смешения и разделения», в соответствии с ранее опубликованными данными[122, 123]. Присоединение пептоидного остатка на каждом этапе включалореакцию ацетилирование и SN2 замещения. Реакция ацетилирования проводиласьв 25 мл стеклянном сосуде для пептидного синтеза (Chemglass) в шейкереинкубаторе с постоянно поддерживаемой температурой в 37 °С в течение 10минут, в котором смешанные шарики были помещены в смесь, состоящую из1,5 мл 2,0 М хлоруксусной кислоты в безводном диметилформамиде и 1,5 мл2.0 М диизопропилкарбодиимида в безводном диметилформамиде.
На этапе SN2замещения шарики были случайным образом разделены на 9 порций. Каждаяпорция шариков инкубировалась с одним из первичных аминов (2 М раствор 1метил-2-пирролидона,пиперониламина,этаноламина,триптамина,(R)-метилбензиламина,аллиламина,1,4-диаминобутана,изобутиламина,фурфуриламина, метоксиэтиленамина) в реакционном стеклянном сосуде дляпептидного синтеза при постоянном перемешивании при 37 °С в течение 90минут. Повторение двух вышеописанных этапов приводило к удлинениюполипептоидной цепи.
Введение пролинового остатка было проведено путемсмешиваниешариков(гексафторфосфатв400 мМрастворомпролина400 мMO-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурони)иHBTU800 мMдиизопропилэтиламина в диметилформамиде при комнатной температуре втечение 1,5 часов. Реакция введения пролинового остатка была повторена- 53 -дважды. После этого Fmoc-защитная группа была удалена при добавлении 20%пиперидина, а два последних случайных пептоидных остатка были введены такимже способом, как описано выше. После этого девять порций шариков былиобъединены.
Половина синтезированной библиотеки (500 мг) была отрезана отшариков носителя в 5 мл 95%-го раствора трифторуксусной кислоты, 2,5% воды,2,5% триизопропилсилана. Другая половина библиотеки была отмыта отпродуктов реакции в избытке дихлорметана и диметилформамида, после чегобыланейтрализована20%растворомдиизопропилэтиламинавдиметилформамиде в течение 15 минут, затем промыта еще раз дихлорметаном.Шарики носителя, содержащие синтезированную пептоидную библиотеку,хранились при 4 °С.2.4.2 Скрининг пептоидной библиотекиДляидентификациисоединений,связвающихсясамино-концевымучастком хантингтина использовался биотинилированный N-концевой пептидхантингтина N20, имеющий следующую аминокислотную последовательность:bio-MATLEKLMKAFESLKSFQQQ. Идентификация пептоидов основывалась натой особенности библиотеки, что один шарик носителя содержит одноуникальное пептоидное соединение. Шарики носителя (120 мг, что соответствуетпримерно60000шарикам),содержащиесинтезированнуюпептоиднуюбиблиотеку, инкубировались в буферном растворе TBST (состав раствора 50 мMTris pH=7,4, 150 мM NaCl, 0,1% Tween 20) в течение одного часа.
После этогошарики инкубировались в буфере для связывания следующего состава: раствора10 мг/мл лизата E. coli и 0,5% BSA в TBST в течение одного часа. После этогошарики инкубировались с биотинилированным пептидом bio-N20 (200 нМ) вбуфере для связывания в течение ночи. Несвязаннные белки были удалены путемпромывания шариков раствором TBST дважды. После этого шарики носителя,содержащие пептоидную библиотеку, инкубировались со стрептавидином,меченым квантовыми точками Qdot (5 нМ, Molecular Probes, США) в течение 1,5часов.
Все вышеописанные манипуляции проводили при температуре 4 °С. Послеудалениенесвязавшейсяметкишарикивизуализирвоалиприпомощи- 54 -флуоресцентного микроскопа Olympus 1X70 с длиной волны возбуждения 410 нм.Голубые шарики, имеющие красную кайму квантовых точек, отбирались вручнуюпри визуальном контроле в микроскоп и использовались для идентификациипоследовательности пептоидов.2.4.3 Идентификация пептоидов и их синтезКаждый индивидуальный шарик, характеризующийся красной каймой, былнагрет в 30 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия при 90 °С в течение20 минут, промывался форсфатно-солевым раствором PBS.
Шарики былисеквенированы по методу Эдмана для определения последовательностейпептоидов. Пики сопостовлялись современамиудержания9 остатков,использованных при синтезе первичной библиотеки. Выбранные пептоиды былиповторно синтезированы, как описано выше при синтезе первичной пептоиднойбиблиотеки.Индивидуальныепептоидныесоединениядлядальнейшихисследований были синтезированы на шариках носителя Knorr Amide MBHA resin(Novabiochem, Германия) следуя такому же протоколу, как описано при синтезепервичной пептоидной библиотеки. После завершения процедуры синтезапептоидов, шарики были промыты раствором дихлорметана и отрезаны относителя путем инкубации в 2 мл раствора 95% трифторуксусной кислоты, 2,5%воды и 2,5% триизопропилсилана в течение 1,5 часов при комнатной температуре.Трифтуоруксусная кислота была удалена под струей азота (в течение 20 минут),после чего пептоды были очищены от продуктов реакции с помощьювысокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
Для элюции пептоидаиспользовалась градиентная элюция 10-50% раствором Б в течение 60 минут,после чего использовалась градиентная элюция 50-80% раствором Б в течение 5минут (раствор А: 0,1% раствор трифторукскусной кислоты в воде; раствор Б:0,1% раствор трифторукскуной кислоты в ацетонитриле). Для каждогоиндивидуального пептоида пики, соответствующие пептоидному соединению,были исследованы масс-спектрометрически MALDI-TOF (метод матрицеактивируемой лазерной десорбции-ионизации с времяпролетным детектором).- 55 -2.4.4 Определение константы связывания HNP1-N17Для определения константы связывания пептоида HNP1 с участкомхантингтинаN17использовалсяметодизотермическойтитрационнойкалориметрии на приборе NANO ITC (TA Instruments).
Ячейка содержала 170 мклочищенного MBP-Htt-17Q в концентрации 30 мкМ. HNP1 пептоид (концентрацияраствора 300 мкМ) вводился в ячейку спомощью шприца. Количество теплоты(ΔH), выделяемой после каждого введения измерялось во времени.
Криваясвязывания былаполучена путем построения зависимости ΔH каждого введенияот отношения концентраций лиганда и белка в ячейке.2.5 Культивирование клеток2.5.1 Клеточные культурыВ работе использовались следующие клеточные линии: HEK293T, Sf9,первичные культуры нейронов гиппокампа и смешанные кортико-стриатальныекультуры нейронов.2.5.2 Условия культивированияАдгезионную клеточную линию HEK293T культивировали в стандартнойсреде DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой (Gibco). Суспензию клеток Sf9культивировали бессывороточной среде Sf900 II. Плотность и выживаемостьклеток Sf9 определяли ежедневно с помощью окраски красителем трипановымсиним (при нормальном клеточном росте выживаемость составляла >95%,плотность клеток была в пределах 0,5-5*106кл/мл). Культивирование клетокHEK293T и первичных культур нейронов проводилось при температуре 37 °С ватмосфере, содержащей 5% CO2. Культивирование клеток Sf9 проводилось при 26°С и постоянном перемешивании культуральных флаконов при 120 об/мин.2.5.3 Получение первичных культур нейроновПервичные культуры нейронов получали от новорожденных мышат P0-P1линий FVB-Tg(YAC128)53Hay/J (мышиная модель болезни Хантингтона, JacksonLaboratories), Sigma1R-KO (получены от TEVA Pharmacuticals) и мышей дикого- 56 -типа [145, 146, 204, 205].
Гиппокамп или кортекс и стриатум были выделены идиссоциированы с помощью папаина (37 °С, 30 минут) и ДНКазы I (5 мг/мл).Нейроны культивировали на покровных стеклах, предварительно покрытых 1%раствором поли-D-лизина (Sigma-Aldrich, Германия) в среде Neurobasal-A (Gibco,США) дополненной 2% B-27 (Gibco, США), 1% инактивированной FBS (Gibco,США), 0,5 мМ L-глутамином (Gibco, США) в инкубаторе при 37 °С и 5% СО2.Для последующего анализа в интерисующий момент времени культурыфиксировали 4% раствором формальдегида в PBS.2.5.4 Трансфекция клеточных линийТрансфекцию клеточной линии HEK293T осуществляли с помощьюреагента полиэтиленэмина (ПЭЭ) (1 мг/мл, Sigma-Aldrich, США).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
