Автореферат (1141400), страница 4
Текст из файла (страница 4)
К 2 мл свежеприготовленной липосомальной дисперсии илирегидратированной ЛЛФ-лио борхлорина (к содержимому флакона добавляют 3,7 млводы и перемешивают) прибавляют 3 мл спирта 95% и перемешивают. На линиюстарта хроматографической пластинки наносят по 4 мкл исследуемого образца ЛФборхлорина (борхлорин – 0,4 мкг) и спиртовых растворов стандартных образцов15веществ-свидетелей (СОВС): борхлорина с концентрацией 0,1 мг/мл (СОВС-1 – 0,4мкг), ФХ с концентрацией 18,0 мг/мл (СОВС-2 – 72,0 мкг) и Хол с концентрацией 3,2мг/мл (СОВС-3 – 12,8 мкг).
После подсушивания на воздухе пластинку снанесенными пробами помещают в хроматографическую камеру с элюентом, плотнозакрывают крышкой и хроматографируют восходящим способом. После достиженияфронтом элюента линии финиша (пробег 12 см) пластинку вынимают из камеры ивысушивают в потоке теплого воздуха до полного удаления запаха растворителя.Борхлорин идентифицируют на пластинке визуально по характерным зеленым пятнамбез использования специфических реактивов. Для обнаружения ФХ пластинкупомещают в камеру, насыщенную парами йода, и выдерживают около 1 мин допоявления ярко-желтых пятен ФХ. Совместно с ФХ проявляются светло-желтыебыстро исчезающие пятна Хол.
Обнаружение Хол проводят, опрыскивая пластинкуразведенной серной кислотой с последующим нагреванием до появленияхарактерных розово-фиолетовых пятен данного вещества.2) Выбор подвижной фазы. Поскольку значительное влияние на разделение веществ втонком слое сорбента оказывает растворитель, основной задачей данногоисследования являлся выбор подвижной фазы, обеспечивающей эффективноеразделение компонентов ЛФ борхлорина с последующей их идентификацией. Напервоначальном этапе было изучено 16 типов элюирующих систем различногосостава (табл. 6).Таблица 6Выбор подвижной фазы для разделения борхлорина и липидных компонентов ЛФСистема растворителейхлороформ/метанол 9:1хлороформ/этанол 20:1хлороформ/этанол 10:1хлороформ/этанол/вода 65:25:4хлороформ/ацетон/ледяная уксусная кислота/вода25:15:5:4хлороформ/аммиак 25% 4:1хлороформ/аммиак 25% 19:1хлороформ/ацетон/этилацетат/ледяная уксусная кислота/вода 15:10:10:3:3ацетон/этилацетат/ледяная уксусная кислота/вода15:10:3:5ацетон/этилацетат/ледяная уксусная кислота 3:2:1пропанол/хлороформ/ледяная уксуснаякислота/вода 27:23:3:1пропанол/аммиак 25%/ледяная уксуснаякислота/вода 15:15:3:5пропанол/ледяная уксусная кислота/вода 12:3:1бутанол/хлороформ/ацетон/ледяная уксуснаякислота/ вода 25:25:15:5:4бутанол/ледяная уксусная кислота/вода 6:3:2бутанол/ледяная уксусная кислота/вода 12:3:5борхлоринЛФ СОВС-10,200,120,060,020,130,081,001,00Значение RfФХЛФСОВС-20,060,040,030,01стартстарт0,090,08ЛФ0,910,770,950,90ХолСОВС-30,910,770,950,900,560,480,260,221,001,000,080,080,060,02стартстартстартстарт0,690,610,670,610,230,170,040,040,970,970,660,670,020,020,850,900,05старт0,030,030,780,780,220,220,030,030,800,800,970,970,080,081,001,000,360,130,040,040,900,900,360,340,140,070,840,890,500,630,500,650,090,300,090,320,670,840,670,8616В результате анализа данных табл.
6 установлено, что система бутанол/ледянаяуксусная кислота/вода (6:3:2) обеспечивает наилучшее разделение борхлорина(Rf=0,50) и Хол (Rf=0,67), в то время как ФХ практически остается на старте.Поскольку ни одна из предложенных систем не подходит для обнаружения ФХ,необходимо было подобрать другую систему растворителей для ТСХ-анализа этогокомпонента.
Поиск элюирующей системы, которая обеспечивала бы эффективноеразделение ФХ в ЛФ, проводили на 13 подвижных фазах, представленных в табл. 7.Как видно из табл. 7, наибольшее значение коэффициента подвижности (Rf) дляФХ как в составе ЛФ (0,48), так и в СОВС-2 (0,48) обнаружены при использованиисистемы растворителей хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода всоотношении 6:2:2:1:1. Именно данная система была выбрана для качественногоТСХ-анализа ФХ в составе ЛФ борхлорина.Таблица 7Выбор подвижной фазы при ТСХ-анализе ФХ в составе ЛЛФ и ЛЛФ-лио борхлоринаСистемаРастворителихлороформ/этанол/пропанол/ледяная уксусная кислота/водаСоотношениехлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/водахлороформ/пропанол/водахлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/водабутанол/хлороформ/ледяная уксусная кислота/ водабутанол/хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/водабутанол/ацетон/ледяная уксусная кислота/водаацетон/ледяная уксусная кислота/водаЗначение Rf ФХЛФСОВС-26:4:2:2:10,33*0,29*40:10:7:340:7:7:540:7:7:340:5:7:56:3:16:2:2:1:16:2:2:2:16:2:2:4:18:5:4:225:25:10:10:45:3:1:115:3:20,500,410,41старт0,060,480,40*0,26*0,210,120,060,020,770,410,37старт0,040,480,36*0,23*0,120,070,060,02Примечания: * размытые пятна.2.1.2.
Разработка методики ТСХ-анализа сахарозы, входящей в состав ЛЛФ-лиоборхлорина1) Методика. Лиофилизат регидратируют путем добавления 3,7 мл воды, 1 млполученной липосомальной дисперсии переносят в колбу вместимостью 100 мл идоводят до метки водой. На хроматографическую пластинку наносят по 2 мклисследуемого образца ЛЛФ-лио (сахароза – 2,0 мкг) и водного раствора СОВСсахарозы с концентрацией 1 мг/мл (СОВС-4 – 2,0 мкг). Пластинку помещают вхроматографическую камеру с элюентом, плотно закрывают крышкой ихроматографируют восходящим способом.
После достижения фронтом элюенталинии финиша (пробег 12 см) пластинку вынимают из камеры и высушивают навоздухе до полного удаления запаха растворителя. Пластинку опрыскивают 0,5%17раствором α-нафтола (смесь спирта 95% и концентрированной серной кислоты 19:1по объему) и нагревают до появления темно-фиолетовых пятен сахарозы.2) Выбор подвижной фазы. В качестве элюента для ТСХ-анализа сахарозы в составеЛФ выбрана система растворителей ацетон/ледяная уксусная кислота/вода (15:3:2)(табл. 8), которая обеспечивала хорошее разделение пятен сахарозы с наилучшимзначением Rf=0,55.
Пятна борхлорина, ФХ и Хол при анализе сахарозы нахроматографической пластинке не обнаруживались.Таблица 8Выбор подвижной фазы для ТСХ-анализа сахарозы в составе ЛЛФ-лио борхлоринаСистема растворителейхлороформ/этанол 20:1хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/вода 40:7:7:5хлороформ/этанол/ледяная уксусная кислота/ацетон/вода 6:2:2:1:1хлороформ/аммиак 25% 4:1бутанол/ледяная уксусная кислота/вода 6:3:2бутанол/этанол/вода 6:3:2ацетон/этилацетат/ледяная уксусная кислота/вода 15:10:3:5ацетон/ледяная уксусная кислота/вода15:3:2Значение RfЛФСОВС-4стартстарт0,140,120,200,160,920,920,350,280,350,370,440,360,550,55Проведена оценка пригодности выбранных хроматографических систем дляТСХ-анализа компонентов ЛЛФ борхлорина путем определения пределаобнаружения вещества. Пределы обнаружения компонентов ЛФ борхлорина и оценкапригодности систем приведены в диссертации.2.2. Разработка и валидация методики спектрофотометрического анализаборхлорина в составе ЛЛФЦелью настоящего исследования являлась разработка точной и чувствительнойметодики определения содержания борхлорина в ЛФ.Как видно на рис.
6А в диапазоне от 200 до 800 нм обнаружено 4 основныхмаксимума: (217±2), (400±2), (499±2) и (662±2) нм. На рис. 6Б показано, что спектрпоглощения спиртового раствора липосомального борхлорина в диапазоне 300-800нм идентичен спектру поглощения спиртового раствора субстанции борхлорина поположению максимумов и форме кривой. Таким образом, электронный спектрпоглощения липосомального борхлорина может применяться для определенияподлинности борхлорина в ЛФ.Для количественного анализа борхлорина в разработанной ЛФ нами выбранаполоса поглощения средней интенсивности с максимумом (662±2) нм, посколькуданный пик является разрешенным, узким и позволяет измерять оптическуюплотность концентрированных липосомальных дисперсий борхлорина.18АБРис. 6. А – Электронный спектр поглощения спиртового раствора субстанции борхлорина(концентрация борхлорина в растворе 2 мкг/мл), Б – Спектры поглощения спиртовыхрастворов: 1 – субстанции борхлорина, 2 – ЛЛФ-лио борхлорина, 3 – «пустых» липосомДля изучения влияния вспомогательных веществ на абсорбционныехарактеристики борхлорина в ЛЛФ и ЛЛФ-лио исследовали спектр поглощения«пустых» липосом (рис.
6Б). В области спектра от 300 до 800 нм показано, чтовспомогательные компоненты исследуемой ЛФ, а также используемый растворительне поглощают в области максимумов борхлорина и, таким образом, не влияют наспектральные характеристики ФС. Это говорит о специфичности методикиобнаружения борхлорина в ЛФ методом спектрофотометрии.Линейность методики подтверждали измерением аналитических сигналов для5 проб с различными концентрациями борхлорина в модельной смеси компонентовЛФ в пределах диапазона от 80 до 120% от заявленного содержания в препарате(1,0 мг/флакон). Значение коэффициента корреляции составило 0,9992, чтосвидетельствует о наличии достаточно тесной линейной связи между концентрациейборхлорина и оптической плотностью в заданном диапазоне концентраций.Уравнение регрессии для данной линейной зависимости имеет вид у=1,726х-0,011.Определение правильности методики проводили методом добавок намодельных смесях компонентов ЛФ борхлорина, вносимого в концентрациях 80, 100и 120% от заявленного содержания в препарате.
Установлено, что отклонения отсреднего значения (1,0±0,01) укладываются в интервал концентраций борхлорина(0,85-1,15 мг/флакон), заявленных в проекте НД на ЛЛФ-лио борхлорина,относительная погрешность среднего результата не превышает 2%.Повторяемость методики оценивали по результатам, полученным водинаковых условиях в одной лаборатории одним и тем же исполнителем в пределахкороткого промежутка времени на 6 образцах ЛЛФ-лио борхлорина одной серии.Коэффициент вариации составил значение 0,634%, что свидетельствует о19незначительной изменчивости вариационного ряда и прецизионности методики вусловиях сходимости.
Относительная погрешность определения не превышала 2%.Для подтверждения внутрилабораторной прецизионности измерялисодержание борхлорина в 6 пробах ЛЛФ-лио одной серии, полученных в условияхработы одной лаборатории разными аналитиками в разные дни. При анализерезультатов обнаружено, что рассчитанное значение критерия Фишера (Fрас=2,03) непревышало его табличного значения (Fтаб=5,05). При сравнении расчетного итабличного значения критерия Стьюдента также выполнялось неравенствоtрас=0,33<tтаб=2,23, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибкиизмерений.
На основании вышеизложенного можно сделать вывод о том, чторасхождения результатов анализа, полученных двумя исследователями, случайны.При оценке устойчивости (робастности) методики исследовали стабильностьаналитических растворов во времени при изменении факторов внешней среды (свет итемпература). Установлено, что аналитические растворы, хранящиеся в различныхусловиях, устойчивы не менее чем 24 ч, поскольку значение концентрацииборхлорина в растворе оставалось практически неизменным в течение данногопериода времени.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
