Диссертация (1141269), страница 11
Текст из файла (страница 11)
22). Уравнения калибровочных прямых и коэффициентыкорреляции представлены в таблице 22.Таблица 22.Уравнения калибровочных прямых и коэффициенты корреляциидля исследуемых ГЛСВеществоУравнение калибровочнойпрямойКоэффициент корреляции rАтенололy = 6141,19*x0,99988Бисопрололy = 11588,1*x0,99916Верапамилy = 24131,7*x0,99901Метопрололy = 6302,58*x0,99958Пропранололy = 9210,13*x0,99954Эналаприлy = 13588,6*x0,9993185Рисунок 22. Калибровочные графики для атенолола, бисопролола, верапамила,метопролола, пропранолола и эналаприла.Калибровочная зависимость для нифедипина (Рис 23) не может быть описана в данных условиях линейной функцией с требуемой правильностью и прецизионностью, однако наблюдается степенная зависимость вида y= 4156,8*x1,0779, коэффициент корреляции (r) составляет 0,99985.
Данную зависимость можно считать приемлемой, так как не существует нормативной документации,предъявляющейтребованиякметодикамхимико-токсикологического анализа, а европейское руководство по валидации биоаналитических методик допускает использование любой математической зависимости при условии, если методика демонстрирует требуемые правильность ипрецизионность.Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанные покалибровочным уравнениям, укладываются в допустимые нормы отклонений(±20% для нижней точки аналитического диапазона и ±15% для остальных точек).86Рисунок 23.
Калибровочный график для нифедипина.При оценке правильности и прецизионности проводили анализ 4 образцов интактной плазмы с прибавлением стандартного раствора атенолола, бисопролола, метопролола, нифедипина, пропранолола и эналаприла до полученияконцентраций около: 10, 100, 2500, 5000 нг/мл и 4 образцов интактной плазмы сприбавлением стандартного раствора верапамила до получения концентрацийоколо: 10, 100, 1000, 2500 нг/мл. Анализ каждого раствора осуществляли по 5раз в рамках трёх аналитических циклов.
Для полученных значений концентраций были рассчитаны величины относительного стандартного отклонения(RSD, %) и относительной погрешности (ε, %), приведенные в таблице 23.87Таблица 23.Правильность и прецизионность методики внутри одного аналитического циклаи между цикламиВнутри циклаВведено,нг/млНайдено,среднее(n=5),ЭналаприлПропранололБисопрололМетопрололАтенололнг/млМежду цикламиRSDε(n=5),(n=5),%%Найдено,среднее(n=10),нг/млRSDε(n=10),(n=10),%%9,809,239,32-5,809,348,18-4,7298,0092,914,16-5,2093,954,45-4,132450,002542,153,213,762524,333,833,034900,004515,755,36-7,844617,586,01-5,767,617,309,79-4,077,298,91-4,1976,0883,852,1410,2284,292,0210,791901,901912,176,880,541889,976,25-0,633803,803335,482,74-12,313454,935,22-9,178,458,061,72-4,588,071,64-4,5584,5084,662,850,1984,672,460,202112,602026,089,32-4,102009,197,19-4,894225,203961,195,32-6,253983,384,92-5,729,148,981,35-1,718,941,82-2,1891,4297,391,496,5397,052,426,162285,452182,239,17-4,522147,546,96-6,034570,904234,674,46-7,364295,194,12-6,037,737,148,54-7,697,247,59-6,3077,2576,4512,21-1,0375,6410,12-2,081931,251917,876,42-0,691888,165,09-2,233862,504089,455,745,884060,214,645,12НифедипинВерапамил889,549,274,71-2,859,184,64-3,7695,4095,231,09-0,1895,291,30-0,11954,04929,634,19-2,56920,973,39-3,472385,102447,138,242,602447,956,912,649,619,7911,001,849,779,161,6896,1492,025,55-4,2992,244,58-4,052403,452471,912,772,852478,082,613,104806,904973,162,953,464913,262,762,21За нижний предел количественного определения (нПКО) методики принималась минимальная концентрация ГЛС в плазме, для которой возможно ихколичественное определение со значениями RSD и ε не более 20 % в диапазонелинейной зависимости, а соотношение сигнал/шум составляло не менее 10/1.Предел количественного определения методики составил 9,80 нг/мл для атенолола, 8,45 нг/мл для бисопролола, 9,54 нг/мл для верапамила, 7,61 нг/мл для метопролола, 9,81 нг/мл для нифедипина, 9,14 нг/мл для пропранолола и 7,73нг/мл для эналаприла.
Хроматограмма, демонстрирующая нПКО методики,приведена на Рисунке 20.Была подтверждена стабильность для стандартных растворов ГЛС (прихранении раствора в течение 14 дней при температуре от 2°С до 8°С), кратковременная стабильность (для приготовленных проб в течение 24 ч при анализена следующий день при температуре 5°С) и долгосрочная стабильность ГЛС вматрице (в условиях заморозки) на уровнях концентраций 10,00 и 5000,00 нг/мл(2500 нг/мл для верапамила). Образцы выдерживали 3 цикла заморозкиразморозки. Площадь пика при повторных анализах не менялась более чем на15 %.При последовательном анализе проб с концентрацией ГЛС, соответствующей верхней точке аналитического диапазона, и интактной плазмы на хро-89матограмме интактной плазмы отсутствовали пики, соответствующие по времени удерживания ГЛС.
Таким образом, перенос пробы отсутствовал.Степень извлечения (recovery, RE) оценивалась как выраженное в процентах отношение площади пика ГЛС, полученной при пробоподготовке и анализе пробы интактной плазмы с добавлением стандартных растворов ГЛС кплощади пика того же вещества, полученной при анализе пробы интактнойплазмы, в которую раствор ГЛС добавляли после проведения пробоподготовки.Эффект матрицы (matrix-effect, ME) при ионизации DUIS и МС/МСдетектировании рассчитан как отношение площади пика ГЛС полученной прианализе пробы интактной плазмы, в которую раствор ГЛС добавляли послепроведения пробоподготовки к площади пика того же вещества, полученнойпри анализе пробы, в которой вместо интактной плазмы взят равный объёмподвижной фазы.
Данные по извлечению и эффекту матрицы представлены втаблице 24.Таблица 24.Степень извлечения и эффект матрицы при анализе ГЛС методомВЭЖХ-МС/МСВеществоСтепень извлечения (RE), %Эффект матрицы (МЕ), %Калибровочный уровень714(6 для вера-714памила)(6 для верапамила)Атенолол34386510010895Метопролол40407011511593Бисопролол41376111410694Пропранолол39386211710291Эналаприл5148581069486Нифедипин747453109131151Верапамил3739591171039590Несмотря на невысокую степень извлечения ГЛС при предложенной пробоподготовке, осаждение белков плазмы ацетонитрилом, тем не менее обеспечивает желаемый нПКО, что в сочетании с простотой и быстротой данного способа пробоподготовки позволяет считать его оптимальным для решения задачхимико-токсикологического анализа.4.2.2.ВалидацияметодикиопределенияэналаприлаиэналаприлатаВалидация методики количественного определение эналаприла и эналаприлата в плазме крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС выполнена по следующим характеристикам: селективность, линейность, правильность (внутрицикла и между циклами), прецизионность (внутри цикла и между циклами),предел количественного определения, перенос пробы, стабильность растворов[105, 106, 107].Селективность методики оценивали при сравнении хроматограмм пробинтактной («чистой») плазмы с прибавлением стандартных растворов эналаприла и эналаприлата с хроматограммами проб интактной плазмы.
На хроматограмме пробы интактной плазмы не наблюдается пиков, соответствующих повременам удерживанию эналаприлу и эналаприлату.При оценке линейности проводили анализ 6 проб интактной плазмы с добавлением стандартного раствора эналаприла и эналаприлата до полученияконцентраций 5, 15, 25, 50, 75 и 100 нг/мл.
Построены калибровочные графикидля эналаприла (Рис. 24) и эналаприлата (Рис. 25). Уравнение калибровочнойпрямой для эналаприла имеет вид y = 83568,3x, коэффициент корреляции (r) составляет 0.99985, свободный член линейного уравнения не отличается от 0.Уравнение калибровочной прямой для эналаприлата имеет вид y = 7125,53x,коэффициент корреляции (r) составляет 0,99913, свободный член линейногоуравнения не отличается от 0.
Отклонения концентраций калибровочных растворов, рассчитанные по уравнениям линейной зависимости, укладываются вдопустимые нормы отклонений (±20% для нижней точки аналитического диапазона и ±15% для остальных точек).91Рисунок 24. Калибровочная прямая для эналаприла.Рисунок 25. Калибровочная прямая для эналаприлата.92При оценке правильности и прецизионности проводили анализ 4 образцов интактной плазмы с прибавлением стандартного раствора эналаприла иэналаприлата до получения концентраций: 5 нг/мл, 15 нг/мл, 50 нг/мл, 100нг/мл.
Анализ каждого раствора осуществляли по 5 раз в рамках двух аналитических циклов. Для полученных значений концентраций были рассчитаны величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительнойпогрешности (ε, %), приведенные в Таблицах 25 и 26.Таблица 25.Правильность и прецизионность методики внутри аналитического циклаВведеноНайдено (нг/мл), среднее зна-S.D.RSD, %(нг/мл)чение (n=5)(n=5)(n=5)ε, %Эналаприлат5,004,740,183,75-5,1215,0015,770,734,625,1550,0049,932,274,54-0,14100,00100,151,301,290,15Эналаприл5,004,580,265,67-8,4015,0015,060,191,230,3750,0050,501,482,921,00100,00100,462,632,620,46Таблица 26.Правильность и прецизионность методики между аналитическими цикламиВведеноНайдено (нг/мл), среднее зна-S.D.RSD, %(нг/мл)чение (n=10)(n=10)(n=10)ε, %Эналаприлат5,004,650,245,12-7,0015,0015,260,825,381,759350,0049,731,933,87-0,53100,00100,021,601,600,02Эналаприл5,004,540,255,42-9,1615,0015,060,221,440,4050,0050,401,232,440,80100,00100,381,921,910,38Нижний предел количественного определения (нПКО) методики определяли на основании данных линейности, правильности и прецизионности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
