Диссертация (1141269), страница 7

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 7)

Реактив Либермана достаточно специфичен в отношении пропранолола, однако с остальными веществами он даёт окраски, которые похожи47между собой. Смесь концентрированных серной и азотной кислот также даётс разными веществами во многом схожие окрашивания. В целом, идентификация гипотензивных лекарственных веществ по реакциям окрашивания носит субъективный характер.ТСХ в химико-токсикологическом анализе используется как предварительный скрининговый метод. Соответственно, методика должна позволятьобнаруживать ГЛС в пробах, не давая ложноотрицательных результатов.Чтобы соответствовать этим требованиям, скрининг ГЛС в моче методом ТСХ необходимо отдельно параллельно проводить, используя два видаэкстракции: использовать систему Toxi Tube А для слабых оснований и ToxiTube В для слабых кислот (эналаприл).

Далее полученные экстракты параллельно хроматографируют в двух системах: этилацетат - этанол - конц. раствор аммиака (10:30:1) – для слабых оснований, экстракт из Toxi Tube А ихлороформ - ацетон - ледяная уксусная кислота (10:2:2) – для эналаприла,экстракт из Toxi Tube В. Проявление пластин следует осуществлять реактивом Либермана.Предложенная методика скрининга ГЛС в моче методом ТСХ можетбыть использована как экономичный предварительный метод групповойидентификации гипотензивных лекарственных веществ. Ввиду низкой селективности методики необходимо проведение подтверждающего анализа другим аналитическим методом.48ГЛАВА 3.

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ СКРИНИНГАГИПОТЕНЗИВНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ПРИ ОСТРЫХОТРАВЛЕНИЯХ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСССПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ3.1. Материалы и методы3.1.1. ОборудованиеИсследование проводилось на газовом хроматографе Thermo Trace GCUltra с одноквадрупольным масс-спектрометрическим детектором DSQ II(Thermo Fisher Scientific, США). Обработка данных осуществлялась с использованием программного обеспечения Xcalibur 2.1 (Thermo Fisher Scientific, США).Для приготовления растворов и проведения пробоподготовки использовалось следующее оборудование: Весы лабораторные Shimadzu AUW 120D (Shimadzu, Япония); Вортекс-шейкер V-3 SkyLine (Elmi, Латвия); Лабораторная центрифуга CM 6M (Elmi, Латвия); Лабораторный шейкер S-3 (Elmi, Латвия); Система концентрирования экстрактов Omega-12 с электрическойплиткой и одноразовыми алюминиевыми виалами для упаривания (всоставе системы TOXI LAB, Varian, США); Дозатор переменного объёма Eppendorf Research® plus 100-1000 мкл(Eppendorf, Германия); Дозатор переменного объёма Eppendorf Research® plus 10-100 мкл(Eppendorf, Германия).3.1.2.

Растворы и реактивыПри приготовления стандартных растворов и при пробоподготовке были использованы следующие реактивы:49 этанол 96% (Медхимпром, Россия) этилацетат (extra pure, Scharlau, Испания) дифениламин (чда, Acros organics, Бельгия) метанол (extra pure, Scharlau, Испания) формальдегид, раствор 37% (pure, Scharlau, Испания) вода очищеннаягелий для газовой хроматографии (чистота 99,999%, Центрогаз, Россия)образцы мочи человека, не содержащие анализируемых веществ(интактная, или бланковая, моча)3.1.3. Стандартные образцы Атенолол (≥98%, SIGMA, годен до 10.2015) Бисопролола гемифумарат (≥98%, SIGMA, годен до 04.2016) Верапамила гидрохлорид (≥99%, SIGMA, годен до 03.2016) Метопролола тартрат (вторичный стандарт, соответствует USP,SIGMA-ALDRICH, годен до 06.2016) Нифедипин (≥98%, SIGMA, годен до 05.2016) Пропранолола гидрохлорид (вторичный стандарт, соответствуетUSP, SIGMA-ALDRICH, годен до 08.2017) Эналаприла малеат (вторичный стандарт, соответствует USP,SIGMA-ALDRICH, годен до 11.2015)3.1.4.

Приготовление растворов и пробоподготовкаДля приготовления исходного стандартного раствора в мерную колбувместимостью 100 мл помещали 10,0 мг ГЛС (в пересчёте на основание и сучётом чистоты стандартного образца), прибавляли 25 мл этанола, перемешивали до полного растворения, доводили объём раствора до метки тем жерастворителем (таблица 11). В полученном растворе концентрация ГЛС составляла 100 мкг/мл.

Далее отбирали 2 мл исходного стандартного раствора,помещали в мерную колбу вместимостью 20 мл, доводили до метки этанолом50и перемешивали (таблица 12). Концентрация ГЛС в полученном растворе составляла 10 мкг/мл.Таблица 11.Приготовление исходных стандартных растворовГЛСНавеска,Этанола до,Концентрация,мгмлмкг/мл100,00100,00Атенолол10,20Бисопролола гемифумарат11,90Верапамила гидрохлорид10,87Метопролола тартрат12,99Нифедипин10,20Пропранолола гидрохлорид11,63Эналаприла малеат13,33Таблица 12.Приготовление рабочих стандартных растворовИсходного стандартного раствора сЭтанола до,Концентрацияконцентрацией ГЛС 100 мкг/мл, млмлГЛС, нг/мл0,90200,00450,001,50200,00750,001,50100,001500,001,5020,007500,001,5010,0015000,007,5010,0075000,00Для приготовления исходного раствора внутреннего стандарта 10,00 мгдифениламина (ДФА) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл ирастворяли в 20 мл метанола, затем доводили объём раствора до метки метанолом и перемешивали.

5 мл полученного раствора помещали в мерную кол-51бу вместимостью 25 мл, доводили объём раствора до метки метанолом и перемешивали. Концентрация дифениламина в полученном рабочем растворевнутреннего стандарта составляла 20,00 мкг/мл.Пробоподготовка образцов мочи проводилась методом ЖЖЭ с использованием стандартных экстракционных систем Toxi Tube А (AgilentTechnologies) для веществ нейтрального и слабоосновного характера и ToxiTube B (Agilent Technologies) для веществ слабокислого и нейтрального характера. Toxi Tube А содержит в качестве экстрагента 2,3 мл смеси гептан –изопропанол – 1,2-дихлорэтан – дихлорметан (77 : 38 : 58 : 58 по объёму), натрия хлорид как высаливающий агент и смесь карбоната и гидрокарбонатанатрия в качестве буфера.

Toxi Tube B содержит в качестве экстрагента 2,3мл смеси гептан – дихлорметан (105 : 125 по объёму), цинка хлорид как высаливающий и создающий кислую реакцию среды агент. Процедура пробоподготовки одинаковая для обеих систем.В Toxi Tube помещали 3 мл мочи больного либо 2,8 мл интактной мочис прибавлением 200 мкл стандартного раствора ГЛС, добавляли 30 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта. Концентрация ДФА в пробе составляла200 нг/мл, концентрация ГЛС при прибавлении к интактной моче стандартных растворов составляла 30, 50, 100, 500, 1000, 5000 нг/мл.Экстракцию проводили на шейкере с частотой 100 об/мин в течение 3минут.

Слои разделяли центрифугированием в течение 5 минут со скоростью3200 об/мин. После центрифугирования отбирали органическую фазу (верхний слой) и упаривали досуха. Сухой остаток перерастворяли в 200 мкл этилацетата или метанола. В хроматограф вводили 2 мкл полученного экстракта.Toxi Tube А использовали в случае ненаправленного скрининга или дляподтверждения отравлений веществами слабоосновного и нейтрального характера – пропранололом, атенололом, метопрололом, бисопрололом, нифедипином.

Для экстракции эналаприла, обладающего слабокислыми свойствами, целесообразно использовать Toxi Tube B. Однако, поскольку эналаприлможет извлекаться из мочи и при слабощелочных значениях рН, для унифи-52кации способа пробоподготовки при ненаправленном анализе была выбранаэкстракция с использованием системы Toxi Tube А.Для получения формилированных производных в пробирку с навинчивающейсякрышкойвносили50мклстандартногораствораβ-адреноблокатора с концентрацией 100 мкг/мл, 2,5 мл воды очищенной и 0,5мл формалина. Далее полученную смесь нагревали на песчаной бане в течение 15 мин, охлаждали, проводили экстракцию 3 мл этилацетата на шейкерес частотой 100 об/мин в течение 3 мин. Затем пробирки центрифугировали 5мин со скоростью 3200 об/мин.

Отбирали органическую фазу (верхний слой),упаривали досуха. Сухой остаток перерастворяли в 200 мкл этилацетата.3.1.5. Разработка хроматографической методикиХроматографическое разделение производили на колонке TR-5MS,длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина плёнки неподвижной жидкой фазы 0,25 мкм. Фаза – 5% дифенил, 95% – диметилполисилоксан. Газ-носитель – гелий. Температура инжектора – 220°C, интерфейса –280°C, ионного источника – 200°C.

Детектирование проводили по полномуионному току в диапазоне m/z 41–650, ионизация электронным ударом сэнергией 70 eV. Начало регистрации сигнала – через 4,5 мин после вводапробы. Объём вводимой пробы 2 мкл, образец вводили в инжектор хроматографа в режиме без деления потока.Изначально разделение проводилось по следующей температурнойпрограмме: 50°C – 0,5 минуты, нагрев 100°C/мин. до 100°C, 100°C – 1 минута, нагрев 15°C/мин. до 280°C, 280°C – 20 минут.Установлено, что при анализе с использованием описанной выше температурной программы в интервале времени от 10 до 15 минут расположеныпики пропранолола, бисопролола, метопролола, атенолола и нифедипина.Анализ проб мочи показал в дальнейшем, что в этом же промежутке находятся пики некоторых метаболитов нифедипина, а также других веществ, которые не являются объектами данного исследования. В этих условиях создаётся риск неполного разделения пиков или их наложения.53Для улучшения разрешения была модифицирована температурная программа: 50°C – 0,5 минуты, нагрев 100°C/мин.

до 190°C, 190°C – 1 минута,нагрев 10°C/мин. до 280°C, 280°C – 13 минут.Изменение программы привело к сокращению времени анализа на 8минут. Замедление в 1,5 раза скорости нагревания на участке 190-280°C позволило добиться улучшения разрешения пиков на данном участке.Рисунок 1. Хроматограммы экстракта из мочи пациентки Р. Слева –исходный метод; справа – модифицированный метод. 1 – метопролол, 2 –артефакт метопролола, 3 – пропранолол, 4 – артефакт пропранолола, 5 –метаболит метопрололаРазрешение пиков 1 и 2 (степень разделения) рассчитано по формуле:RS  tR 1 1    12гдеtR2 ,2- разность времён удерживания разделяемых компонентов, 1 1 и2 1 2 - полуширина пика.2Для исходной программыR s  10 , 8, а для модифицированнойТаким образом, удалось улучшить разрешение примерно в 1,5 раза.R s  16 , 2.543.2.

Результаты и обсуждениеНа рисунках 2-5 представлены масс-спектры пропранолола, бисопролола, метопролола и атенолола, полученные в описанных выше условиях.5942urA_hyp2 #445 RT: 10.66 AV: 1 SB: 2 10.61 , 10.73 NL: 2.81E6T: + c Full ms [41.00-650.00]72.131009080Relative Abundance706050403020115.111056.1373.19102.1889.11116.16144.12128.12157.1806080100120140160m/z215.18183.22180206.59244.19238.28200220240259.28260.24260Рисунок 2. Масс-спектр пропранолола.bisopr10_spirt #549 RT: 12.10 AV: 1 SB: 2 12.05 , 12.37 NL: 6.24E5T: + c Full ms [41.00-650.00]72.151009080Relative Abundance70605040302010 43.12116.2073.15100.22050100207.10 222.32123.13 147.13 165.18 189.32150200253.27281.23250m/zРисунок 3.

Характеристики

Список файлов диссертации