Диссертация (1141211), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Индекс массы тела составлял неболее 25,9 кг/м2 у 26 (92,8%) пациентов. Средняя продолжительность заболеванияравнялась 8,63±5,21 годам (от 1 до 26 лет). В 11 (39,2%) случаях выявленадиффузная форма заболевания, в 17 (60,8%) - лимитированная. У большинствапациенток диагностировано хроническое течение заболевания – 23 (82,1%), чтосовпадало со второй стадией патологического процесса.Для 14 (50,0%) пациентов настоящая госпитализация являлась повторной поповоду данного заболевания в течение последних 12 месяцев. В период более 12месяцев и до 3 лет были госпитализированы 11(39,2%) больных.
У 3 (10,7%)пациенток отмечалась стабилизация состояния в срок, превышающий три года.46При обследовании пациентов обнаружена сопутствующая патология сердцау 21 (75,0%), сосудов у 17 (60,8%), легких у 9 (32,1%), ЖКТ у 8 (28,6%), почек у 3(10,7%), мышц у 4 (14,3%), кожи у 19 (67,9%), костей и суставов у 15 (53,6%),нервной системы у 2 (7,14%) больных.
У 12 (42,9%) исследуемых выявленадислипопротеидемия.В1(3,6%),19(67,9%)и12(42,9%)случаях,соответственно, диагностировано заболевания миокарда, в том числе ИБС,артериальная гипертензия и нарушение сердечного ритма.Большинство пациентов на догоспитальном этапе принимали блокаторымедленных кальциевых каналов - 27 (96,4%) и ангиопротекторы - 24 (85,7%),глюкокортикоиды - 17 (60,7%), ингибиторы АПФ – 4 (13%), НПВП - 4 (14,3%),антиагреганты – 2 (7,14%), аминохинолиновые препараты – 1 (3,6%), цитостатики- 1 (3,6%).У 24 (85,7%) пациентов в ходе стационарного лечения было достигнутоклиническое улучшение.
В 4 (14,3%) случаях положительной динамикиклинической симптоматики не наблюдалось. Повторно госпитализированы через12 месяцев от начала исследования 12 (42,9%) больных. Случаев летальногоисхода зарегистрировано не было.472.2 Методы исследованияВыделение нейтрофиловДля выделения нейтрофилов из периферической крови использовали метод,основанный на двойном градиенте плотности фиколла-урографина [48]. Напервом этапе для изготовления градиентных растворов смешивали фиколл(«Pharmacia», Швеция) и урографин («Shering Plough», Германия).
Дляприготовления растворов использовали бидистиллированную воду. Для растворас плотностью ρ = 1,119 г/см3 брали 20 частей 9% фиколла и 10 частей 50%урографина. Раствор с плотностью ρ = 1,077 г/см3 изготавливали из 24 частей 9%фиколла и 10 частей 34% урографина. Для измерения плотности полученныхрастворовприменялиденситометрвусловияхкомнатнойтемпературы.Стерилизовали полученные растворы при помощи метода фильтрации через порыдиаметром 0,22 мкм.На втором этапе в предварительно гепаринизированные (из расчета 20 Едгепарина на 1 мл крови) стерильные силиконированные пробирки («Biochemy»,Австрия) забирали венозную кровь.Выделение нейтрофилов проводили непозднее 60 минут от взятия пробы.Для разведения крови использовали раствор Хенкса без фенолового красного впропорции 1:2. Далее в стерильные пробирки в соотношении 3:3:4 поочереднонаслаивали полученные растворы с плотностью ρ = 1,119 г/см3 и плотностью ρ =1,077 г/см3 и разведенную кровь.
Полученный материал центрифугировали втечение 30 минут при 400g.По окончании центрифугирования на границах растворов формировалисьдва кольца клеток, состоящие из мононуклеаров и нейтрофилов. На дно пробиркиоседали кровяные элементы с более высокой плотностью. Для дальнейшегоанализа брали клетки второй интерфазы, на 95% состоящую из нейтрофилов.Полученную взвесь для отмывки в течение 10 минут дважды центрифугировали сраствором Хенкса при 200g и доводили до концентрации 5х106/мл.48Далее по трипановому тесту оценивали жизнеспособность фагоцитов,составляющую неменее 90%. В камере Горяева подсчитывали количествонейтрофилов в клеточной суспензии с применением прижизненной окраскираствором метиленового синего в 3% уксусной кислоте (краска Тюрка) дляопределения жизнеспособных клеток [25].Проведение хемилюминесценции с нейтрофиламиДля определения функциональной активности нейтрофилов применялихемилюминесцентныйметод[24].Длясохранениядостаточногоуровняхемилюминесценции и максимального уменьшения действия сывороточныхфакторов полученные нейтрофилы (0,1 мл) отмывали в растворе Хенкса 1:100 безфенолового красного с добавлением гепарина (10 ЕД на 1мл).В качестве индукторов хемилюминесценции применяли люминол (5-амино2,3-дигидро-1,4-фталазиндион), усиливающий хемилюминесценцию таких АФК,как пероксид водорода, супероксидный радикал, гидроксил-анион, анионгипохлорной кислоты и нитроксильный радикал, в конечной концентрации 50мкМ или люцигенин (10,10’-диметил-9,9’-биакридиндинитрат), являющийсяселективным показателем супероксид-аниона, в конечной концентрации 0,1 мМ[15].Далее в сцинцилляционных флаконах (объем 20 мл) проводили темновуюадаптацию и последовательно смешивали 1 мл разведенной клеточной суспензиии 0,1 мл люминола и люцигенина (Boehringer Mannheim, Германия).
Полученныерастворы инкубировали при температуре +37,4С в течение 15 минут, следомрегистрировали показания спонтанной хемилюминесценции на жидкостносцинцилляционном счетчике «Бета-1» (КПО «Медаппаратура», Украина).Результаты выражали количеством импульсов в минуту на одну клетку(имп/мин).49Определение коэффициента активации нейтрофиловПрипомощиспонтаннойлюминол-илюцигенинзависимойхемилюминесценции делали выводы о степени функциональной активностинейтрофилов, о функциональном резерве клеток судили по коэффициентамактивации хемилюминесценции (КА ХЛлл и КА ХЛлн), рассчитанные, какотношение индуцированного показателя (иХЛлл и иХЛлн) к спонтанному (сХЛллисХЛлн).Индукторомкислородзависимогометаболизманейтрофиловиспользовали 1109 взвесь убитых нагреванием клеток S.
aureus штамма p-209.Длявыполненияиндуцированнойхемилюминесценциивофлаконыснейтрофилами добавляли 0,1 мл взвеси.Культивирование нейтрофиловДля получения смеси, пригодной для культивации к выделеннымнейтрофилам в количестве 2 х 106/мл, разнесенным в 24-луночные планшеты(«Nunc Brand Products», Дания), ресуспендированным в жидкой стерильнойпитательнойсредеRPMI-1640(«Биолот»,Россия),добавляли10%инактивированную фетальную телячью сыворотку («GibcoBRL», Англия), 30 мкгL-глутамина(«SigmaDiagnostics»,США),100МЕ/млпенициллина(«Yamanouchi», Япония) и 100 мкг/мл стрептомицина («GibcoBRL», Англия).Полученную суспензию клеток инкубировали при температуре +370С в течение 6часов в увлажненной атмосфере с 5% содержанием углекислого газа [29].Определение суммарного содержания метаболитов оксида азота (NO3/NO2) всреде инкубации нейтрофиловПри помощи реактивов Грисса проводили количественное определениесуммарного содержания метаболитов оксида азота (NO3/NO2) в среде инкубациинейтрофилов.
Для данного анализа в пробирку добавляли 150 мкл культуральнойсреды, полученной после 6-ти часового культивирования клеток, и 75 мкл 1,5%раствора сульфаниламида («Fluka», Германия) в 1N соляной кислоте и 75 мкл500,15% N-(1-нафтил)-этилендиаминдихлорида в дистиллированной воде («Fluka»,Германия), затем доводили объем раствора до 1 мл. Спустя десять минут наспектрофотометреСФ-46определялиоптическуюплотностьполученныхрастворов при 540 нм и вычисляли концентрацию суммарных нитрит-ионов покалибровочной кривой в мкМ/л. Для контроля использовали полную среду сдобавлением реактива Грисса.Концентрацию метаболитов оксида азота в пробах рассчитывали спомощью калибровочной кривой. В качестве стандарта использовали растворнитрита натрия в концентрациях от 0 до 100 мкМ.
Абсолютную продукциюметаболитов оксида азота определяли с учетом количества нейтрофилов укаждого донора и пациента, включенного в исследование.Определение концентрации эстрадиола кровиСодержание эстрадиола в сыворотке крови человека определяли методомтвердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора реагентовИммуноФА-Эстрадиол (ЗАО «НВО Иммунотех», Россия). Перед проведениеманализакомпонентынабораиисследуемыеобразцысывороткикровивыдерживали при температуре +20-250С в течение 30 минут. Построениекалибровочной кривой проводили для каждой серии анализов.В два ряда лунок планшета вносили в дубликатах по 25 мкл калибровочныхпроб, начиная с минимальной концентрации.
В две лунки планшета добавляли по25 мкл контрольной сыворотки, в оставшиеся лунки вносили в дубликатах по 25мкл исследуемых образцов сывороток крови. Во все лунки планшета в той жепоследовательности, что и калибровочные пробы, контрольную сыворотку иисследуемые образцы вносили по 100 мкл конъюгата. Тщательно перемешивалисодержимое лунок, поместив планшет на шейкер, при комнатной температуре+(20-25оС) в течение 2-3 минут.
Инкубировали пробы при температуре +37оС втечение 1,5 часов, избегая попадания прямого солнечного света.Содержимое лунок удаляли декантированием, дважды отмывали фосфатносолевым буферным раствором. По окончании промывки тщательно удаляли51остатки жидкости из лунок. Во все лунки планшета вносили по 100 мкл растворасубстрата в той же последовательности, что и конъюгат. Инкубировали планшетпри температуре +37оС в течение 10-15 минут, избегая попадания прямогосолнечного света.Во все лунки планшета с той же скоростью и в той же последовательности,как и раствор субстрата, вносили по 100 мкл стоп-реагента. Тщательноперемешивали содержимое лунок, поместив планшет на шейкер, при комнатнойтемпературе в течение одной минуты. Измеряли оптическую плотность проб влунках планшета с помощью фотометра вертикального сканирования (ShimadzuCorp., Япония) при длине волны 450 нм.Определение концентрации тестостерона кровиДля определения концентрации тестостерона в сыворотке крови методомтвердофазного иммуноферментного анализа использовали реактивы ИммуноИФА-тестостерон (ЗАО «НВО Иммунотех», Россия).Начиная с минимальной концентрации, вносили по 20 мкл калибровочныхпроб в два ряда лунок планшета.
В две лунки планшета добавляли по 20 мклконтрольной сыворотки, в оставшиеся лунки вносили в дубликатах по 20 мклисследуемых образцов сывороток крови. Во все лунки планшета вносили по 100мкл конъюгата, тщательно перемешивали содержимое лунок, поместив планшетна шейкер, при температуре +20-25оС в течение 2-3 минут. Инкубировалиобразцы при температуре +37оС в течение одного часа, избегая попаданияпрямого солнечного света.Содержимое лунок удаляли декантированием, дважды отмывали планшетвнесением в каждую лунку 250 мкл рабочего фосфатно-солевого буферногораствора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
