Диссертация (1139934), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Это обосновывает использование в качестве клеточного компонентадермальных фибробластов кожи человека. Матриксами для создания ТИК быливыбраны полипропиленовая и проленовая сетки. Основная задача третьего этапа109– создание прототипа ТИК с аутологичным клеточным компонентом человека вусловиях in vitro для дальнейшего использования клинических условиях.На последнем этапе исследования клеточную культуру (дермальныефибробласты) выделяли из образца кожи размером 2х3х1 мм. Забор производилсяу исследователя в условиях процедурного кабинета. Для исключения возможныхвоспалительных и инфекционных заболеваний заранее подопытный проходилклинико-лабораторную диагностику.Полученные тканевые образцы помещали в транспортную среду с 3-хкратным добавлением антибиотиков (3% раствор пенициллина/стрептомицина,Invitrogen). В лаборатории производилась тщательная промывка в изотоническомзабуференным фосфатом растворе (PBS).
Далее ферментативная диссоциацияполученных после характеризации человеческих дермальных фибробластовпроводилась в течение 1 часа при температуре 370С при помощи добавленияколлагеназы II типа (Gibco) до конечной концентрации 0,075%. Затем равнымобъемом питательной среды DMEM/F12 (Gibco), содержащей 10% фетальнойбычьейсыворотки(FBS,HyClone)сдобавлением1%растворапенициллина/стрептомицина (Invitrogen) инактивировали коллагеназу. Послецентрифугирования суспензию, находящейся в 15 мл культуральной среды,культивировали на культуральный флакон (25см2, Corning). Полученнуюпервичную клеточную культуру инкубировали в атмосфере, содержащей 5% СО2с повышенной влажностью при температуре 370 С.
Замена питательной средыпроизводилась каждые 48 часов. Пассаж клеток производили с добавлением0,25% раствора трипсина/EDTA (Gibco) (рисунок 83).110Рисунок 83 - Первичная клеточная культура дермальных фибробластов кожичеловека (ДФ в виде веретенообразных клеток). Стрелка указает на адгезивнуюклетку. Увеличение ×200, фазовый контраст.На данном этапе оценивалась динамика покрытия полипропиленовыххирургических сеток дермальными фибробластами человека в условиях in vitroОценка производилась при помощи светового микроскопа. Через суткификсировали начало адгезии клеток с волокнами проленовой сетки (рисунок 84).К 12 суток происходило полное покрытие нитей имплантата клетками и началозаполнения мелких ячеек в углах пересечения волокон (рисунок 85).Рисунок 84 - Сетка с дермальными фибробластами человека на 1 сутки посленанесения.
Увеличение × 200, фазовый контраст. Стрелкой указано наадгезированную клетку.АБРисунок 85 - 12 сутки после культивирования ДФ человека на матрицы,отмечается начальное заполнение ячеек сеток после завершения покрытия111волокон клетками. Хирургические сетки: А- полипропиленовая, Б – проленовая.Увеличение × 100, фазовый контраст.К 30 суткам культивирования дермальных фибробластов на хирургическиематрицы отмечали постепенный рост колоний клеток, частично полное закрытиепространств между волокнами в обеих сетках (рисунок 86).АБРисунок 86 - Сетки (А - полипропилен, Б – пролен) с ДФ человека на 30 сут.после нанесения.
Стрелка указывает на закрытую ячейку полипропиленовойсетки культурой дермальных фибробластов. Ув. × 40, фазовый контраст.К 60 суткам наблюдения на полипропиленовой сетке ДФ располагались внесколько слоев, нити матрикса были полностью покрыты клетками, апромежутки между нитями –не возможно было дифференцировать за счетклеточного роста (рисунок 87).Рисунок 87 – Многослойная тканеинженерная конструкция на полипропиленовомматриксе с дермальными фибробластами человека.
Увеличение х 100.112ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕВ течение последних десятилетий в гинекологической практике особоевнимание отдано проблеме пролапса гениталий. Актуальность обусловленараспространенностью, ранним выявлением и высокой частотой рецидивов.Отмечается тенденция к «омоложению» данного заболевания. В настоящее время«золотым стандартом» лечения тазового пролапса является хирургическоевмешательство. Использование сетчатых протезов при пластике промежностисопровождается более низким процентом рецидивов (5–40%), но, несмотря на это,имеются mesh-ассоциированные осложнения (2–10%). Одним из путей решенияданной проблемы может являться создание тканеинженерных конструкций длявосстановления фасциальных дефектов тазового дна.Тканевая инженерия является областью регенеративной медицины, котораядалавозможностьиспользованияаутологичногоклеточногокомпонента(мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и дермальных фибробластов)для выращивания в условиях in vitro клеточной культуры и культивирования наразличные хирургические матриксы.
Наиболее важным элементом успехаявляется наличие необходимого количества функционально активных клеток,способных дифференцироваться, поддерживать соответствующий фенотип ивыполнять конкретные биологические функции.В данном исследовании использовались хирургические имплантаты,наиболее часто применяемые во время оперативных вмешательств в передовыхгинекологических и хирургических стационарах России на примере клиникиакушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева. В качестве бионедеградируемыхсетчатых имплантатов были выбраны: полипропиленовые сетки с разнымдиаметром монофиламентных волокон и видом плетения, а так же сетка«титановый шёлк».
Наравне с нерассасывающимися имплантатами широкимиспользованием обладают композитные сетки, содержащие в своем составеполипропиленовые и полиглактиновые волокна. Для оценки тканевой реакцииорганизма на внедрение инородных имплантатов были взяты биодеградируемые113матриксы: хирургическая сетка из гликолевой кислоты и L-молочной кислоты(викриловая сетка) и биологический имплантат из свиного дермальногоколлагена.Тканеинженерныеконструкции,созданныенаосновевыбранныххирургических матриксов покрывались клеточной культурой, полученной на базеотдела передовых клеточных технологии института Регенеративной медициныПМГМУ им. И.М.
Сеченова. В качестве рабочей гипотезы в данной работе былапредложена возможность создания тканеинженерной конструкции с полнымаутологичнымпокрытием,котороесмоглобыполностьюизолироватьимплантационный материал от окружающей тканевой реакции. Клеточноепокрытиеиспользовалосьдляобеспечениядополнительнойармирующейфункции за счет синтеза коллагена, входящего в состав внеклеточного матрикса.Внеклеточный матрикс составляет основу соединительной ткани, обеспечиваямеханическую поддержку клеток и транспорт химических веществ.В данном работе были получены результаты световой, конфокальноймикроскопий, гистологического и иммуногистохимического исследований.Световая микроскопия применялась для оценки скорости образованияклеточного монослоя на хирургических имплантатах.
На основании полученныхрезультатов,можноконстатировать,чтоиспользованиемезенхимальныхстромальных клеток костного мозга и дермальных фибробластов равнозначно. Нодля клинической практики забор клеточной культуры дермальных фибробластовменее травматичен, сопровождается меньшим количеством осложнений ицелесообразней с экономической точки зрения.Наибольшее покрытие дермальными фибробластами на поверхности сетокбыло отмечено в группе облегченных полипропиленовых сеток (активный ростклеток фиксировался вокруг более тонких волокон с переходом в углы ячеек).Такие особенности могут быть связаны с различными эффектами, оказываемымиволокнами, входящими в состав сеток.
Так, в экспериментах с использованиемкультивированных фибробластов человека показано, что ингибирующий эффектна рост фибробластов оказывает контакт с полипропиленом.114Конфокальнаямикроскопияподтвердилажизнеспособностьвсехполученных тканеинженерных конструкций в условиях in vitro и это даётвозможность применения их в условиях in vivo.В результате гистологического исследования была проведена сравнительнаяхарактеристика степени зрелости соединительной ткани и возникновения лимфомакрофагальной инфильтрации на имплантацию контрольной полипропиленовойсетки и тканеинженерной конструкции, покрытой МСК КМ на её основе.
Приотсутствиихирургическихосложнений,соединительнаятканьвокругимплантируемой ТИК отличалась зрелостью и минимальном воспалительнойреакцией в отличии от контрольной сетки у того же животного.Производилась оценка тканевой реакции на тканеинженерные конструкциив контрольные сроки забора на гистологическое исследование на разных типахбионедеградируемого, биодеградируемого и композитного матрикса, покрытыхдермальными фибробластами.ТИКнаосновеполипропиленовогоматериалапродемонстрироваланаилучшее восприятие тканью реципиента: наименее выраженная клеточнаяреакция, достаточное полнокровие капилляров, менее выраженный отекокружающих тканей.ТИК на основе титановой сетки сохраняла признаки незрелости на раннихсроках исследования (рыхлая структура образованной соединительной ткани,макрофагальная инфильтрация), однако к 14 суткам отмечался сформированныйтрабекулярный каркас из волокон соединительной ткани с отсутствием какихлибо воспалительных изменений.ТИК на основе викриловой хирургической сетки на 21 сутки послеимплантации демонстрировала полное срастание с прилежащими тканями, а также вокруг нитей сетки образовывалась фиброзная ткань, формирующая единуюплотную структуру.ТИК на основе композитной сетки к конечной контрольной точкеисследования формировала псевдокапсулу вокруг имплантируемого материала,115представленного молодой соединительной тканью из коллагеновых волокон ифибробластно-коллагенового каркаса вокруг сетки.Тканевая реакция на ТИК на основе биологического имплантата из свиногоколлагена была представлена неоваскуляризацией имплантата, а активностьвоспалительной реакции соответствовала нормальному течению раневогопроцесса.Иммуногистохимическое исследование проводилось с целью оценкистепенипролиферации(белокKi-67),апоптоза(Caspase-3,Caspase-9),антиапоптоза (Bcl-2), ангиогенеза (СD 31, Col3A1).
В результате имплантацииТИКнаосновеполипропиленовойсеткибылотмечено:снижениеапоптотического эффекта при довольно высоком уровене антиапоптотическогоэффекта, уменьшение степени пролиферации, повышение уровня ангиогенеза. Засчетпокрытиябионедеградирующейсеткиаутологичнымидермальнымифибробластами снижалась запрограммированная гибель клеток и увеличиваласьплотность сосудистой сети, что приводило к снижению риска отторжения ТИКорганизмом крысы. Схожие эффекты наблюдались при имплантации ТИК натитановом матриксе.В результате имплантации ТИК на основе композитной сетки былоотмечено: умеренно выраженные уровни антиапоптотического, апоптотическогоэффектов, средняя степень пролиферации, выраженное снижение степениангиогенеза.В результате имплантации ТИК на основе биодеградируемых матриксовотмечались: умеренная пролиферативная активность клеток и активацияпроапоптотическихCaspasa-3-зависимыхпроцессов,приводящихкапоптотической гибели фибробластов.Таким образом, все изученные нами бионедеградируемые эндопротезы икомпозитныематриксыхарактеризуютсявыраженнойинтеграциейсокружающими тканями в зоне имплантации лабораторным животным, чтопозволяет нам рекомендовать их для дальнейшего исследования с цельювнедрения в клиническую практику.116У ТИК на полипропиленовой сетке с МСК КМ получили следующиеиндексы: пролиферации – 11,5 ± 0,58; воспаления – 9.38 ± 0,71; регенерации –1,23.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
