Автореферат (1139686), страница 5
Текст из файла (страница 5)
3).В концентрации 100 мкМ витамин А проявляет стимулирующий эффект:катодный пик возрастает пропорционально концентрации витамина А и достигает232±10%.Таблица 3Влияниe витaминa A нa элeктpoкaтaлитичecкиe пapaмeтpы CYP 3A4 впpиcyтcтвии cyбcтpaтa диклoфeнaкa и ингибитopa итpaкoнaзoлa№1234CиcтeмaЗнaчeниeтoкa (мкA)DDAB/Au + P450 3A4-0,451±0,023DDAB/Au + P450 3A4 + витaмин A (в пpoбe -0,45±0,021 мМ)DDAB/Au + P450 3A4 + диклoфeнaк (в пpoбe -0,46±0,02100 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-0,436±0,021DDAB/Au + P450 3A4 + витaмин A (в пpoбe -1,01±0,034100 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4 + диклoфeнaк (в пpoбe -1,13±0,038100 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-0,87±0,02DDAB/Au + P450 3A4 + витaмин A (в пpoбe -1,0±0,0350 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4 + диклoфeнaк (в пpoбe -1,03±0,04100 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-0,184±0,008DDAB/Au + P450 3A4 + итpaкoнaзoл (в пpoбe -0,158±0,00710 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4 + итpaкoнaзoл + -0,239±0,012витaмин A (в пpoбe 100 мкМ)Знaчeниeтoкa (%)100%100%102%100%232%256%100%115%118%100%86%130%Пpивeдeны cpeдниe знaчeния мaкcимaльнoгo вoccтaнoвитeльнoгo тoкa (выcoтa пикa)КВВA в aэpoбныx ycлoвияx, paccчитaнныe в cepии экcпepимeнтoв (n = 8).
Знaчeнияaмплитyд тoкoв КВВA были cкoppeктиpoвaны пo бaзoвoй линии24Изучение влияния витамина E на активность CYP 3А4Витамин Е в концентрации 100 мкМ также проявляет стимулирующийэффект: катодный пик возрастает пропорционально концентрации витамина Е, ипри концентрации 100 мкМ восстановительный пик CYP 3А4 увеличивается на176±10% (Табл. 4).
Витамин Е в концентрации 1 мМ более эффективно, чемвитамин А, стимулирует рост восстановительного катодного пика CYP 3А4:119±10%.Таблица 4Влияниe витaминa E нa элeктpoкaтaлитичecкиe пapaмeтpы CYP 3A4 впpиcyтcтвии cyбcтpaтa диклoфeнaкa и ингибитopa итpaкoнaзoлaCиcтeмa1234Знaчeниe тoкa(мкA)DDAB/Au + P450 3A4-0,42±0,02DDAB/Au + P450 3A4 + витaмин E (в пpoбe -0,5±0,021 мМ)DDAB/Au + P450 3A4 + диклoфeнaк (в пpoбe -0,51±0,02100 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-0,447±0,023DDAB/Au + P450 3A4 + витaмин E (в пpoбe -0,789±0,033100 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4 + диклoфeнaк (в пpoбe -0,759±0,025100 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-0,593±0,022DDAB/Au + P450 3A4 + витaмин E (в пpoбe -0,675±0,024330 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4 + диклoфeнaк (в пpoбe -0,702±0,025100 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-0,43±0,02DDAB/Au + P450 3A4 + итpaкoнaзoл (в пpoбe -0,338±0,02010 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4 + итpaкoнaзoл + -0,464±0,029витaмин E (в пpoбe 100 мкМ)Знaчeниeтoкa (%)100%119%121%100%176%169%100%114%118%100%79%108%Пpивeдeны cpeдниe знaчeния мaкcимaльнoгo вoccтaнoвитeльнoгo тoкa (выcoтa пикa)КВВA в aэpoбныx ycлoвияx, paccчитaнныe в cepии экcпepимeнтoв (n = 8).
Знaчeнияaмплитyд тoкoв КВВA были cкoppeктиpoвaны пo бaзoвoй линииНесмотря на то, что витамины С, А и Е являются антиоксидантами,выявлены различия в их действии на электрокаталитическое восстановлениеCYP 3А4. Витамин С в разных концентрациях оказывает разнонаправленное25влияние на каталитическую активность CYP 3А4: в низких концентрациях онявляется индуктором работы CYP 3А4, а в высоких – его ингибитором. Согласнонашим экспериментальным данным, витамин Е является как субстратомCYP 3А4, так и его индуктором, в связи с чем не может быть использован длявосстановления его активности в случае ингибирования лекарственнымисредствами.Витамин АнеявляетсясубстратомCYP 3А4иоказываетстимулирующее воздействие на его электрокаталитическую активность.Были проведены исследования каталитической активности CYP 3А4 вприсутствии витамина С как антиоксиданта (Рис.
4). Доказаны антиоксидантныесвойства витамина А и проявление субстратных свойств витамином Е. Вприсутствии витамина С (в концентрации 0,28–1,12 мМ) возрастает катодныйвосстановительный ток CYP 3А4, но витамин А в концентрации 100 мкМ неIcat, %вызывает дополнительного роста восстановительного тока.Витамин C, мМPиcунок 4. Влияниe витaминoв A (100 мкМ) и E (100 мкМ) нa кaтoдныйвoccтaнoвитeльный тoк CYP 3А4 в пpиcyтcтвии витaминa CВ присутствии витамина С и витамина Е наблюдается дополнительный росткаталитического тока, что характерно для электрохимического поведениясубстратов цитохромов Р450. Таким образом, нами выработан и внедреналгоритм, позволяющий на основе анализа электрохимических параметров26дифференцировать фармакологически активные вещества по механизму действияна антиоксиданты и типичные субстраты CYP 3А4.В данном экспериментальном исследовании продемонстрировано, чтовитамины С, А и Е, обладающие антиоксидантными свойствами, влияют накаталитическую активность CYP 3А4. Поскольку восстановление гема цитохромаР450 является основной стадией в катализе и сопровождается генерированиемАФК [Шумянцева В.
В. и др., 2013], вещества, проявляющие антиоксидантныесвойства, могут влиять на каталитические функции этого гемопротеина.Витаминоподобные вещества как индукторы каталитической активностиCYP 3А4 в электрохимическом экспериментеИзучение влияния препарата Кудесан на активность CYP 3А4В серии экспериментов показано, что препарат Кудесан влияет наэлектрохимическуюсоответствуяактивностьвосстановлениюCYP 3А4гемаи(Рис. 5).стимулируеткатодныйток,Увеличениекатодноготокасоставляло 139±11% в присутствии 2 мкл препарата Кудесан, что соответствует20 мкМ(0,009 мг/мл)Стимулированиевитамина Еивосстановительного70 мкМтока(0,06 мг/мл)коэнзимаQ10.можетбытьцитохрома Р450обусловлено синергическим либо суммирующим действием этих двух веществ сантиоксидантными свойствами.Таким образом, по результатам электрохимического анализа можно сделатьвывод о стимулирующем влиянии препарата Кудесан на изофермент CYP 3А4,при этом повышение каталитической активности CYP 3А4 под действием этогопрепарата может повлиять на скорость метаболизма других препаратов приназначении в составе комплексной терапии.
Механизм действия препаратаКудесан, по-видимому, связан с антиоксидантными свойствами его компонентов,коэнзима Q10 и витамина Е. Стимулирующий эффект препарата Кудесан вприсутствииитраконазоланепроявляется,что,возможно,обусловленоблокированием генерации АФК азольным ингибитором итраконазолом. Егоингибирующий эффект связан с образованием комплекса с железом гема,препятствующим активации кислорода.27I, AНативный электрод+ препарат КудесанНативный электрод + CYP 3А4+ препарат КудесанE, В, пo cpaвнeнию c элeктpoдoм Ag/AgClPиcунок 5.
КВВА элeктpoдoв: DDAB/Au/P450 3A4 (cплoшнaя линия);DDAB/Au/P450 3A4 + коэнзим Q10 5 мкл (пyнктиpнaя линия)Изучение влияния таурина на активность CYP 3А4РезультатыэкспериментальногоэлектрохимическуюактивностьизученияCYP 3А4влиянияпоказали,итраконазолачтопринадобавленииитраконазола к электроду DDAB/Au/P450 3А4 не наблюдается увеличениякатодного каталитического тока. Так, среднее значение тока DDAB/Au/P450составило-0,95±0,03 мкАDDAB/Au/P450 3А4(100%),электроду—апридобавлении0,833±0,167 мкАитраконазола(91,2%).кПолученныерезультаты можно объяснить проявлением не только субстратных, но иингибирующих свойств итраконазола по отношению к CYP 3А4.При добавлении таурина (конечная концентрация 50 мкМ) к электродуDDAB/Au/P450 3А4 наблюдается увеличение катодного тока, что обычнохарактерно для субстратов цитохрома Р450.
Антиоксидантные свойства тауринапроявляются в нейтрализации этих АФК, что приводит к стабилизации ферментаи увеличению восстановительного катодного тока. Ингибирующее действиеитраконазола (в концентрации 10 мкМ) в присутствии 50 мкМ тауринасущественно снижается.28В экспериментах с применением итраконазола с последующим внесениемтаурина итраконазол ингибировал CYP 3А4, что проявлялось в отсутствииувеличения каталитического тока (102%). Добавление таурина к электродуDDAB/Au/P450 3А4 в присутствии итраконазола дает прирост регистрируемогокатодного тока (на 131,7%). Таким образом, мы продемонстрировали, что тауриннивелируетингибирующеедействиеитраконазоланацитохром Р450.Полученные данные представлены в Табл.
5.Таблица 5Влияниe тaypинa нa ингибиpyющиe cвoйcтвa итpaкoнaзoлa пo oтнoшeнию кCYP 3А4, peгиcтpиpyeмыe c пoмoщью aнaлизa элeктpoxимичecкиxпapaмeтpoв№1234CиcтeмaЗнaчeниeтoкa (мкA)DDAB/Au + P450 3A4-0,95±0,03DDAB/Au + P450 3A4 + тaypин-1,1±0,04DDAB/Au + P450 3A4 + итpaкoнaзoл (в пpoбe -0,833±0,16710 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-0,86±0,03DDAB/Au + P450 3A4 + тaypин-0,93±0,03DDAB/Au + P450 3A4 + тaypин + итpaкoнaзoл -1,07±0,04(в пpoбe 10 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-1,09±0,03DDAB/Au + P450 3A4 + тaypин-1,23±0,04DDAB/Au + P450 3A4 + тaypин + итpaкoнaзoл -1,52±0,04(в пpoбe 10 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-1,5±0,04DDAB/Au + P450 3A4 + тaypин + итpaкoнaзoл -1,47±0,04(в пpoбe 10 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4 + тaypин + итpaкoнaзoл -1,48±0,04+ диклoфeнaк (в пpoбe 100 мкМ)Знaчeниeтoкa (%)100%116%91,2%100%108%124%100%113%139%100%113%114%Пpивeдeны cpeдниe знaчeния мaкcимaльнoгo вoccтaнoвитeльнoгo тoкa (выcoтa пикa)КВВA в aэpoбныx ycлoвияx, paccчитaнныe в cepии экcпepимeнтoв (n = 8).
Знaчeнияaмплитyд тoкoв КВВA были cкoppeктиpoвaны пo бaзoвoй линииПри оценке N-деметилазной электрокаталитической активности CYP 3А4 вотношении эритромицина показано, что в присутствии 50 мкМ таурина вэлектрохимической системе наблюдается увеличение электрокаталитической29константы на 16% по сравнению с системой, в которой таурин отсутствовал.Данные представлены в Табл. 6.Таблица 6Кинeтичecкиe пapaмeтpы элeктpoкaтaлитичecкoй N-дeмeтилaзнoйaктивнocти CYP 3А4 в oтнoшeнии эpитpoмицинaФepмeнт +cyбcтpaтAнтиoкcидaнт Пpoдyктэлeктpoкaтaлитичecкoйpeaкции (фopмaльдeгид, мкМ)1,15± 0,2CYP3A4+эpитpoмицинCYP3A4+эpитpoмицинТaypин(50 мкМ)1,32± 0,2kcat, мин-13,1±0,3(100%)3,6±0,4(116%)В тaблицe пpивeдeны cpeдниe peзyльтaты тpex cepий oпытoвkcat — элeктpoкaтaлитичecкaя кoнcтaнтaТауринкакантиоксидантснижаетнакоплениеАФКвпроцессеэлектрокатализа, предотвращая тем самым инактивацию фермента, о чемсвидетельствует увеличение скорости N-деметилазной реакции эритромицина,катализируемой CYP 3А4.
Защитная роль таурина в отношении CYP 3А4 былатакже показана на основании способности CYP 3А4 сохранять N-деметилазнуюэлектрокаталитическую активность после электролиза при контролируемомнапряжении (Е = −500 мВ). В процессе электролиза неизбежно происходитнакопление АФК, инактивирующих фермент. Показано, что после электролиза вприсутствии в системе 50 мкМ таурина и эритромицина восстановительныйкаталитический ток CYP 3А4 составлял 71 ± 8%, в то время как в отсутствиетаурина – лишь 52 ± 5% (за 100% был принят каталитический ток CYP 3А4 вприсутствии эритромицина до электролиза при контролируемом напряжении).Таким образом, используя электрохимическое восстановление CYP 3А4 вкачестве инструмента для исследования электрокаталитической активностигемопротеина и оценки влияния различных биологически активных веществ наактивность системы цитохрома Р450, можно сделать вывод о том, что тауринприводит к электрокаталитическому восстановлению CYP 3А4.
При этом тауринснижает ингибирующий эффект итраконазола.30Изучение влияния L-карнитина на активность CYP 3А4L-карнитин является витаминоподобным веществом, которое активноиспользуется в качестве биологически активной добавки для коррекцииразличных состояний. В диапазоне концентраций 186–372 мкМ L-карнитин неоказывал влияния на катодный ток, соответствующий процессу Fe3+ +1е Fe2+.Необходимо отметить, что в присутствии L-карнитина (186 мкМ) диклофенактакже проявляет субстратные свойства: регистрируется каталитический ток,сравнимый с экспериментами без L-карнитина: 125±10% (Табл. 7).Таблица 7Влияниe пpeпapaтa Элькap (лeвoкapнитин) нa элeктpoxимичecкиeпapaмeтpы CYP 3А4№ Cиcтeмa123456Знaчeниeтoкa (мкA)DDAB/Au + P450 3A4-0,21±0,01DDAB/Au + P450 3A4 + L-кapнитин (в пpoбe 186 мкМ) -0,23±0,01DDAB/Au + P450 3A4 + L-кapнитин (в пpoбe 372 мкМ) -0,19±0,01DDAB/Au + P450 3A4-0,44±0,02DDAB/Au + P450 3A4 + L-кapнитин (в пpoбe 186 мкМ) -0,43±0,02DDAB/Au + P450 3A4 + L-кapнитин (в пpoбe 372 мкМ) -0,35±0,02DDAB/Au + P450 3A4-0,39±0,03DDAB/Au + P450 3A4 +L-кapнитин (в пpoбe 186 мкМ) -0,34±0,03DDAB/Au + P450 3A4 + L-кapнитин (в пpoбe 372 мкМ) -0,39±0,02DDAB/Au + P450 3A4-0,24±0,01DDAB/Au + P450 3A4 + L-кapнитин (в пpoбe 186 мкМ) -0,25±0,01DDAB/Au + P450 3A4 + L-кapнитин+ диклoфeнaк (в -0,30±0,02пpoбe 100 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-0,61±0,03DDAB/Au + P450 3A4 + L-кapнитин (в пpoбe 186 мкМ) -0,64±0,03DDAB/Au + P450 3A4 + L-кapнитин+ диклoфeнaк (в -0,68±0,04пpoбe 100 мкМ)DDAB/Au + P450 3A4-0,65±0,03DDAB/Au + P450 3A4 + L-кapнитин (в пpoбe 186 мкМ) -0,60±0,06Знaчeниeтoкa (%)100%109%90%100%98%79%100%87%100%100%104%125%100%105%112%100%92%Пpивeдeны cpeдниe знaчeния мaкcимaльнoгo вoccтaнoвитeльнoгo тoкa (выcoтa пикa)КВВA в aэpoбныx ycлoвияx, paccчитaнныe в cepии экcпepимeнтoв (n = 8).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
