Диссертация (1139576), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Исследования быливыполнены с использованием сканирующей микроскопии, которая позволиласосчитать однородно распределенные дрожжи, располагающиеся по ходупрозрачных акриловых полос.Наиболее точными приборами для измерения шероховатости контактнымметодом и получения трехмерного изображения являются атомно-силовыемикроскопы (АСМ) [20, 56, 401]. Особенностью данных приборов являются:контроль высоты рельефа поверхности с точностью лучше 1 нм, высокоелатеральное разрешение (менее 10 нм), высокое аспектное отношение (высокийуголзаострениянаконечника),возможностьполучениятрехмерногоизображения поверхности.
Трехмерное изображение позволяет оценитьсегментарность, анизотропию текстурированной поверхности [51], то есть имеетбóльшуюинформативность,чемдвухмерныйпрофиль,измеряемыйклассическими профилометрами. Атомно-силовое изображение имеет бóльшуюнаглядность, позволяет визуально отметить особености рельефа, плохоподдающиеся анализу численными методами.1.4.Моделирование биопленок в экспериментах in vitro и in vivoДля изучения процессов формирования микробных биопленок и их влиянияна ткани организма хозяина разработаны различные модели in vitro и in vivo, втом числе для изучения механизмов адгезии пародонтопатогенных бактерий кбазисным и другим материалам, используемым в стоматологии, а такжекомплексная оценка факторов, определяющих адгезию и колонизацию, сиспользованием современных методов микроскопии и иммунохимии [2, 53, 100,139, 334].44Начало изучению заболеваний тканей пародонта положили классическиеработы R.
C. Page с соавт. [368, 369] и R. J.Oringer [365], разработавших моделиэкспериментального гингивита у людей in vivo. Эти исследования внеслизначительный вклад в развитие пародонтологии в результате простой иинструктивной демонстрации этиологической роли бактериальной бляшки пригингивите.
В отечественных исследованиях получили развитие моделилигатурного пародонтита на крысах, предложенные А. И. Воложиным с соавт.[18]. Позднее подобные работы показали роль клеточно-опосредованногоиммунного ответа в этих процессах [429, 310].Группа исследователей под руководством S. Offenbacher (2009) оценилавклад медиаторов воспаления при индукции и редукции экспериментальногогингивита у людей, индуцированного бактериальным налетом [362, 363]. Авторыпоказали, что после удаления бактериального налета снижается экспрессиядеструктивныхмедиатороввоспаления,продуцируемыхвответнабактериальную бляшку.
Хотя эти работы дали инструмент для изучениямеханизмов развития воспалительных заболеваний пародонта, проспективныемеханизмы прогрессирования заболеваний пародонта у людей не могут бытьвыяснены только при исследовании in vivo из-за этических ограничений [469].Это особенно верно в связи с ростом числа работ, показывающих наличиеассоциаций заболеваний тканей пародонта и состояния соматического здоровья[38, 43, 362, 363, 324].Чтобы преодолеть этические ограничения, ранее использовали модели наэкспериментальныхклиническиеживотныхпризнаки[232].Этипрогрессированияработыпомоглипародонтита:установитьпервоначальныйсубклинический гингивит, клинический гингивит и пародонтит с повреждениемтканей пародонта и альвеолярной кости.
Однако перенесение результатовисследований, полученных в экспериментах на животных, на человека имеетопределенные ограничения, включая видовые различия и разнообразиемикрофлоры. Они дают только аналогию процесса заболевания у человека, и,конечно, также возникает проблема этичности использования животных в45качестве моделей заболевания [235].В качестве иллюстрации этой точки зрения можно отметить модель смышиной черепной коробкой, применявшейся для изучения влияния P. gingivalisна костную ткань [150, 233, 313]. Она не связана с полостью рта и не даетинформацию о взаимодействии с эпителиальными тканями, поэтому можноусомниться в ее аналитической значимости. Кроме этого в 90-е гг. прошлогостолетия широко применяли модель введения пародонтопатогенов человека вмышиную ротовую полость.
Но ключевые пародонтопатогены человека неприсущи микрофлоре мышей, поэтому перед назначением антибиотиковнеобходимо снижение содержания резидентной микрофлоры. Вследствие этогоостается под вопросом возможность влияния на организм хозяина и переносаполученных данных на полость рта человека.Таким образом, основной недостаток моделей на экспериментальныхживотных — это то, что они неточно отражают заболевания пародонта, ставябольше вопросов, чем давая ответов. Более того, после работ S. S. Socransky ссоавт.
в конце 90-х гг. P. gingivalis из «красного» комплекса усиленнопреподносили в качестве α-пародонтопатогена, то есть ведущего возбудителя[431]. Поэтому этот вид бактерий был объектом большинства исследований[249]. Тем не менее растущее число работ указывает на важную роль в патогенезезаболеваний пародонта такого вида бактерий, как Filifactor alocis [415].
Болеетого, вклад некультивируемых видов и многовидовых консорциумов еще доконца не оценен [380], что проблематично при моделировании на животных,поэтому исследования in vitro дают с этой точки зрения больше возможностей.Всё это вновь поставило вопрос об актуальности моделирования биопленоки заболеваний тканей пародонта in vitro.Ранее были разработаны модели заболеваний тканей пародонта [268],которые позволили изучить механизмы взаимодействия бактерий разных видовмежду собой. В последнее время в эту концепцию включают участие клетокчеловека [138, 139, 192, 381, 383, 385]. Эти модели имеют преимущества посравнению с исследованиями in vivo из-за этических аргументов.46Кроме того, контролируемые и воспроизводимые системы позволяютоценивать развитие биопленки «в реальном времени», ее состав, влияниемикробов друг на друга и ответ на них клеток организма хозяина.Контролируемые системы имеют большую важность, особенно при изучениииммунных реакций.
Группа исследователей под руководством B. Guggenheim[238] первой применила модель in vitro на основе культивированиямультивидовой биопленки и эпителиальных клеток, которая позволила оценитьвзаимодействие патогенов с клетками организма хозяина [138, 139, 237].Инновационные подходы разработали R. Peyyala с соавторами (2011, 2012) [384,385]. Эти группы исследователей независимо друг от друга показали различияцитокинового и хемокинового ответов на различные бактериальные биопленкии планктонные клетки.C.
K. Hope с соавт. (2012) разработал модель, состоящую из четырех видовбактерий. Данный минималистический подход был применен из-за проблемвоспроизводимости результатов при использовании пулированной слюны илипулированных образцов биопленки [268]. Автор использовал моно- имультивидовые биопленки, растущие на гидроксиапатите в искусственнойслюне с последующим добавлением бактерий. Преимущества этого способа —воспроизводимость, рост на биологически релевантных субстратах и средах,формирование биопленки в форме, похожей на зубной налет.
При этомполучается ограниченное число бактериальных видов, что позволяет оценитьвклад каждого вида в индукцию медиаторов воспаления.В результате было показано, что отдельные бактерии выживаютпредпочтительно при росте в мультивидовых биопленках, по сравнению смонобиопленками.
Это согласуется с другими моделями многовидовыхбиопленок,вкоторыхбылипродемонстрированымутуалистическиевзаимоотношения [378, 453]. Также показан различный цитокиновый ихемокиновый иммунный ответ на патогенные и комменсальные микробы. Хотяи патогенны, и комменсалы влияют на экспрессию и секрецию воспалительныхмедиаторов, патогены предпочтительнее индуцируют экспрессию и секрецию47медиаторов воспаления эпителиальными клетками.
Более того, биопленки P.gingivalis индуцируют экспрессию генов IL-8, тогда как секреция IL-8 некоррелировала с экспрессией генов. Это можно объяснить тем, что бактериивыделяют гингипаины, ключевые иммуномодулирующие компоненты P.gingivalis [344]. Поэтому авторы считают, что данная модель позволяет отличатьпатогены и комменсалы, биопленки от планктонных бактерий.1.5.Антибактериальная терапия и опыт изучения резистентностибактерий к антибиотикам, формирующейся в биопленкахДругой важной стороной проблемы функционирования биопленок ворганизме хозяина является положение о том, что они, как оказалось, открываютдополнительные возможности для реализации механизмов резистентности кантибактериальным агентам. Очевидно, что знание механизмов устойчивостибактерий (резистентности) к антибиотикам имеет крайне важное значение дляуспешной борьбы с инфекционной болезнью [400].В соответствии с фундаментальным документом «Глобальная стратегия посдерживаниюантимикробнойрезистентности»,принятымВсемирнойорганизацией здравоохранения в 2001 г.
[471], в США и большинстве странЕвросоюза распространение антимикробной резистентности рассматриваетсякак одна из угроз национальной безопасности [166, 214]. В феврале 2004 г. наСовещании экспертов ВОЗ в Verinigerode (ФРГ), посвященном ходу реализацииданного документа, было предложено рассматривать феномен антимикробнойрезистентности как новую инфекцию, а мультирезистентные штаммы — вкачестве возбудителя («супербактерии»).Резистентность биопленок к антибиотикам развивается в силу несколькихмеханизмов (таблица 2). Одним из механизмов является природная, изначальноприсущая данным микроорганизмам резистентность. Другим механизмомявляетсяпониженнаядиффузияантибиотиковчерезбиопленкуилидезактивация их внутри внеклеточной матрицы биопленки. Наряду с другими48механизмамиоказываютсвоевлияние,такжепониженныйростмикроорганизмов из-за ограниченного поступления питательных веществ иактивация ответа на стресс [195].Таблица 2Резистентность к антибиотикам у некоторых распространенныхпатогенов, образующих биопленкуВид микробаКласс антибиотиковПримерыStaphylococcusβ-лактам (MRS)Ампициллин(aureus, epidermidis)ХинолоныЦипрофлоксацинStreptococcus mutansГликопептидыВанкомицинPorphyromonas gingivalis ИмидазолыМетронидазолМакролидыЭритромицинPseudomonasβ-лактамыИмипенем, цефтазидимCandida spp.АзолыФлуконазолAspergillusАзолыФлуконазол,итраконазолПриродная резистентность микроорганизмов — это фактор, выходящий напервый план, когда мы рассматриваем такие микробы, как Pseudomonas,метицил-резистентностные Staphylococcus, Streptococcus, Actinomyces.
Этарезистентность биопленки может усилиться в силу факторов окружающейсреды.Например,эффлюксныйнасос(механизмвыводаизклеткиксенобиотиков) у микроорганизмов рода Pseudomonas и Candida можетусилиться в ответ на формирование биопленок [305].Известная высокая резистентность к имипенему у биопленок, образованныхмикроорганизмом Pseudomonas [195, 328], помимо замедленного роста, можетбыть следствием повышенного оттока (эффлюкса).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
