Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 202
Текст из файла (страница 202)
Чтобы различать белки илазматической мембраны человека и мыши, использовали два по разному меченых антитела. Несмотря на то что сначала мышиные и человеческие белки оставались в пределах своих половинок новообразованного гетерокариона, примерно через полчаса два набора белков диф фундировали и смешались по всей клеточной поверхности (рис. (0.35). Скорость латеральной диффузии мембранных белков можно измерить при помощи метода восстановления флуоресг(енции после фогпоотбеливания (г)ЫР). КЛЕТКА мыши КЛЕТКА ЧЕЛОВЕКА мембранный СЛИЯНИЕ белок КЛЕТОК мембранный белок ГЕТЕРОКАРИОН а антитела (л) к мембранному белку человека, меченные родвмином(а) антитела (Л) к мембранному белку мыши, меченные и флуоресцеином (е) время = 0 мин ИНКУБАЦИЯ ПРИ 37 'С время = 40 мин Рис. 10 35.
Эксперимент, демонстрирующий диффузию белкова плвэмвтической мембране гибриднык (мышиных и человеческих) клеток. Сначала мышиные и человеческие белки содержатся в своих половинках новообрвзованной плвзматической мембраны гетерокарионз, посо временем они смешиваются. Двв использованных для визуализации белков антитела различаются в флуоресцентном микроскопе, поскольку флуоресцеин имеет зеленый цвет а родами н — красный. (Основано нэ С О. Егуе эпг) М. Егйибгп, 1 Сей 5сг. 7: 319-335, 1970. С любезного разрешения Тле Согпрапу о( Вю!оз(этэ.) 102. Мембранные белки 991 Обычно, интересукнций мембранный белок метят специфической флуоресцентной группой. Это можно сделать либо при помощи флуоресцентного лиганда, например, связывающего белок меченного флуорофором антитела, либо при помощи метода рекомбинантных ДНК, позволяющего экспрессировать белок, сшитый с зеленым флуоресцентным белком (ОГР) (см.
главу 9). Затем в маленькой области мембраны флуоресцентную группу отбеливают лазерным лучом и измеряют время, необходимое соседним, несущим неотбеленный лиганд или ОГР мембранным белкам для того, чтобы диффундировать в отбеленную область (рис. 10.36, а). Это метод дополняет потеря флдоресценции при фотоотбеливании (Г)иогезсепсе 1 ом ш Рйо1оЫеасй1пп, ГПР). В этом подходе лазерный луч постоянно освещает маленький участок мембраны и отбеливает все флуоресцентные молекулы, которые в него диффундируют. Таким образом, постепенно окружающая мембрана лишается флуоресцентно меченых молекул (рис. 10.3б, б).
Измерения ГОАР и Г1.1Р позволяют рассчитать коэффициенты диффузии маркированных мембранных белков. Значения коэффициентов диффузии существенно изменяются для разных мембранных белков и разных клеток, поскольку взаимодействия с другими белками в разной степени замедляк>т диффузию белков. Измерения для белков, которые наименее подвержены этому процессу, показывают, что клеточные мембраны имеют вязкость, сопоставимукз с вязкостью оливкового масла. Одним из недостатков методов ГКАР и Г1.!Р является тот факт, что они позволяют наблюдать движение только крупных популяций молекул в относительно большой области мембраны; они не позволяют следить за отдельными белками. Например, если белок не мигрирует в отбеленную область, нельзя сказать, является ли молекула неподвижной или ее движение просто ограничено некоторой областью мембраны, например белками цитоскелета.
Меглод отслеживания траектории отдельньп частиц (япд1е-уаг(1с!е (гасЫпд) позволяет преодолеть эту проблему путем мечения отдельных мембранных молекул связанными с флуоресцентными красителями антителами или мельчайшими частицами золота и наблк>дения их движения в видеомикроскопе. При помощи отслеживания траектории отдельных частиц можно записать траекторию диффузии единственной молекулы мембранного белка во времени. Результаты, полученные всеми этими методами, показали, что белки плазматической мембраны значительно различаются по своим диффузионным характеристикам, это мы обсудим ниже. 10.2.11.
Белки и липиды могут придерживаться определенных доменов в пределах мембраны Признание того факта, что биологические мембраны представляют собой двумерную жидкость, сыграло большую роль в понимании структуры и функций мембраны. Однако стало ясно, что представление мембраны как липидного моря, в котором свободно плавают все белки, было значительным упрощением. Многие клетки ограничивают движение мембранных белков пределами определенных областей в непрерывном липидном бислое.
Мы уже обсуждали, как молекулы бактериородопсина в пурпурных мембранах Оа1оЬас1ег1ит собираются в крупные двумерные кристаллы, в которых отдельные молекулы практически неподвижны относительно друг друга (см. Рис, 10.32); такого рода крупные агрегаты диффундируют очень медленно.
В эпителиальных клетках, выстилающих, например, желудочно-кишечный тракт или почечные канальцы, определенные ферменты и транспортные белки плазматической мембраны содержатся только на апикальной поверхности клеток, тогда В92 Часть т))г Внутренняя организация клетки а) ГЯАР 1 От к 1„..!! ,г",."; -, !)сь.. Г $ о ЕЛИВАНИЕ Отбелиадние ЛАЗЕРНЫМ ЛУЧОМ ~ ВЛЕНИЕ время ВОССТАНОВЛЕНИЕ ~ б) ГМР ОТБЕЛИВАНИЕ Отеелиадние ЛАЗЕРНЫМ ЛУЧОМ ~ кх. область отбеленная ях измерения область а х г — — 1 г 1 область отбеленная измерен~гя область аэамя ч ЙООТОянное Отбелиадниб ! г ЙРОЕОВкенз)е ОБЕСЦВЕЧИВВНИЯ Рис.
10.36. Измерение скорости латеральной диффузии мембранного белка методами фотоотбеливания. Интересующий белок можно экспрессировать в составе химерного белка с зеленым флуоресцентным белком (БГР), который флуоресцирует сам по себе. а) В методе ГВАР в маленькой области лазерным лучом отбеливают флуоресцентные молекулы. Интенсивность флуаресценции восстанавливается, по мере того как обесцвеченные молекулы диффундируют из облученной области, а неотбеленные молекулы диффундируют в нее (здесь показан вид сверху и сбоку). Коэффициент диффузии рассчитывают из графика скорости восстановления: чем выше коэффициент диффузии мембранного белка, тем быстрее происходит восстановление. б) В методе ГОР маленький участок мембраны постоянно освещается, а флуоресценция измеряется в другой области.
Флуоресценция во второй области непрерывно снижается, по мере того как флуоресцентные молекулы ее покидают, а отбеленные молекулы в нее входят. В конце концов все флуоресцентные молекулы будут отбелены, при условии, что они подвижны и не заякорены в цитоскелете или внеклеточном матриксе. 10.2. ()()еззбРвиные бевки 993 белок А плотное соединение апикальнвя плазматическа мембрана белок В лвтеральная плазматическа мембрана базальнея плвзмвтическв мембрана У бвзвльнвя пластинка Рис. 10.37. Как движение мембранных молекул может быть ограничено пределами определеннопт домена. На данном изображении зпителнальной клетки белок А (на апикальной мембране) и белок В (на 6 а зал ьной мембране) способны лате рально диффунди ров ать в пределах своих доменов, но не могут проникать в другой домен.
По крайней мере частично зто можно объяснить наличием специализированных межклеточных контактов — плотных соединений. Липидные молекулы во внешнем (нецитоплззматическом) монослое плазматической мембраны также не могут диффундировать между доменами; однако ли лиды во внутреннем (цито плазматическом) монослое могут (не показано). Батальная пластинка представляет собой тонкий слой межклеточ ного матрикса, отделяющий зпители аль ные клетки от других тканей (см.
главу 19). как другие — только на базальной и латеральной поверхностях (рнс. 10.37). Такое асимметричное распределение мембранных белков часто необходимо для функ ционирования эпителия (см. обсуждение в главах 11 и 19). Липидный состав этих двух мембранных доменов также различается, следовательно, эпителиальпые клетки способны ограничить диффузию между доменами не только молекул белков, но и липидов. Однако эксперименты с мечеными .пшндами показали, что такие ограничения действуют только на липиды во внешнем монослое мембраны.
Барьеры, создаваемые особым типом межклеточных контактов (носящих название гьтотньт соединений, или запирающих зон, см. главу 19), поддерживают разделение как белковых, так и липидных молекул. Очевидно, что мембранные белки, образуквцне эти межклеточные соединения.
не могут латергсчьно диффундировать во взаимодействующих мембранах. Клетка может создать мембранный домен без привлечения межклеточных кон тактов. Сперматозоид млекопитающих, например, представляет собой единственную клетку, состоящую из нескольких структурно и функционально различающихся частей и покрытую непрерывной мембраной.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
