Часть 3 (1129751), страница 88
Текст из файла (страница 88)
В любом случае для транспорта нужныспециальные механизмы.Подробности того, как катализируется и регулируется распределение липидовмежду мембранами, неизвестны. Водорастворимые белки, носящие название белковобменников фосфолипидов (или белков-переносчиков фосфолипидов), переносятотдельные молекулы фосфолипидов между мембранами. Они функционируют сходно с белками, связывающими жирные кислоты и проводящими их через цитозоль.Более того, на электронных фотографиях митохондрии часто соприкасаются с ЭР,что указывает на возможное существование специфических механизмов переносалипидов, действующих между прилегающими друг к другу мембранами.ЗаключениеКрупная сеть ЭР служит фабрикой по производству почти всех липидовклетки.
Более того, значительная часть белкового синтеза клетки происходитГлава 12. Внутриклеточные компартменты и сортировка белка 1263на цитоплазматической поверхности ЭР: все белки, предназначенные для секреции и самого ЭР, аппарата Гольджи, лизосом, эндосом и плазматическоймембраны, сначала импортируются из цитозоля в ЭР. В люмене ЭР белкисворачиваются и олигомеризуются, образуются дисульфидные связи и добавляются N-связанные олигосахариды.
Протекание N-связанного гликозилирования указывает на уровень фолдинга белков, поэтому белки покидают ЭР,только если они правильно свернулись. Белки, которые не свернулись или неолигомеризовались, транслоцируются обратно в цитозоль, где дегликозилируются, убиквитинируются и деградируются протеасомами. Если неправильносвернутые белки в избытке накапливаются в ЭР, они запускают реакцию несвернутых белков, которая активирует гены ядра, помогающие ЭР справитьсяс несвернутыми белками.В ЭР импортируются только белки, несущие специальную сигнальнуюпоследовательность ЭР. Сигнальная последовательность узнается сигналузнающей частицей (SRP), которая связывает растущую полипептидную цепьи рибосому и направляет их к рецепторному белку на цитоплазматической поверхности мембраны шероховатого ЭР.
Связывание с мембраной ЭР инициируетпроцесс транслокации, начинающийся с проталкивания петли полипептиднойцепи через мембрану ЭР сквозь гидрофильную пору трансмембранного белковоготранслокатора.Растворимые белки, предназначенные для люмена ЭР, секреции или транспорта в люмен других органелл, полностью проходят в люмен ЭР. Трансмембранные белки, предназначаемые для мембран ЭР и других клеточных органелл,транслоцируются частично через мембрану ЭР и остаются заякореннымитам посредством одного или нескольких пересекающих мембрану α-спиральныхучастков их полипептидных цепей. Эти гидрофобные участки белка могутслужить сигналами начала или остановки транслокации. Когда белок содержит многочисленные чередующиеся стоп- и старт-сигналы транслокации, онбудет несколько раз проходить туда и обратно через бислой и станет многопроходным белком.Асимметрия встраивания и гликозилирования белков в ЭР определяетасимметрию мембран всех органелл, для которых ЭР синтезирует мембранныебелки.ЗАДАЧИКакие из этих утверждений соответствуют действительности? Объясните почему12.1.
Как и люмен ЭР, внутреннее пространство ядра топологически эквивалентно внеклеточному пространству.12.2. Связанные с мембраной и свободные рибосомы структурно и функционально идентичны, они отличаются только белками, которые они синтезируютв данный момент времени.12.3. Чтобы избежать столкновения, которое произойдет, если через одну порубудет происходить движение в обоих направлениях, ядерные поровые комплексыспециализированы: через одни протекает импорт, а через другие — экспорт.12.4. Пероксисомы встречаются только в нескольких специализированныхтипах эукариотических клеток.1264Часть IV. Внутренняя организация клетки12.5. В многопроходных трансмембранных белках нечетные трансмембранныеучастки (если считать с N-конца) служат старт-сигналами транслокации, а четные — стоп-сигналами.Решите следующие задачи12.6. Какова судьба белка, не несущего сигнала сортировки?12.7. Представьте себе, что вы получили набор генов, каждый из которыхкодирует белок с парой конфликтующих сигнальных последовательностей, направляющих белок в разные компартменты.
Предскажите, какой сигнал победитв следующих комбинациях, если эти гены экспрессировать в клетке. Объяснитесвой ответ.а. Сигналы импорта в ядро и импорта в ЭР.б. Сигналы импорта в пероксисомы и импорта в ЭР.в. Сигналы импорта в митохондрии и удержания в ЭР.г. Сигналы импорта в ядро и экспорта из ядра.12.8. В шероховатом ЭР синтезируются различные классы мембранных белков.Некоторые из этих белков остаются в ЭР, другие же сортируются по компартментам, включая аппарат Гольджи, лизосомы и плазматическую мембрану.
Однимиз показателей сложности задачи сортировки является уровень «очистки», которыйнеобходимо достичь во время транспорта в ЭР. Часто ли в ЭР встречаются белки,предназначенные в плазматическую мембрану?Несколько простых соображений помогают ответить на этот вопрос. В типичной растущей клетке, делящейся каждые 24 часа, через ЭР должен раз в деньпроходить эквивалент одной плазматической мембраны.
Если площадь ЭР в 20 разпревышает площадь плазматической мембраны, каково соотношение между белкамиплазматической мембраны и другими мембранными белками в ЭР? (Предположите,что все белки на пути в плазматическую мембрану удерживаются в ЭР в среднемв течение 30 минут и что соотношение липидов и белков в плазматической мембранеи мембране ЭР одинаково.)12.9.
До того как ядерные поровые комплексы подробно изучили, было неясно, пассивно ли диффундируют ядерные белки в ядро и накапливаются тамза счет связывания с такими постоянными структурами ядра, как хромосомы,или они активно транспортируются и накапливаются вне зависимости от сродствак компонентам ядра.В классическом эксперименте, разрешившем эту проблему, использовалосьнесколько радиоактивномеченых форм нуклеоплазмина, крупного пентамерногобелка, участвующего в сборке хроматина. В этом эксперименте в цитоплазму илиядро ооцита лягушки вводили интактный нуклеоплазмин или его головку, хвостили головку с одним хвостом (рис. Q12.1). Все формы нуклеоплазмина, за исключением головок, накапливались в ядре при введении в цитоплазму, и все формыудерживались в ядре при прямом введении в органеллу.а.
Какая часть молекулы нуклеоплазмина отвечает за ядерную локализацию?б. Как эти эксперименты позволили различить активный транспорт, при котором сигнал ядерной локализации запускает транспорт ядерным поровым комплексом, и пассивную диффузию, при которой сайт связывания ядерного компонентаприводит к накоплению в ядре?12.10. Предполагая, что для упаковки человеческого генома требуется 32 миллиона гистонов, сколько молекул гистонов в секунду должно транспортироватьсяГлава 12.
Внутриклеточные компартменты и сортировка белка 1265Рис. Q12.1. Распределение в клетке введенных в нее нуклеоплазмина и его компонентов (задача 12.9).На схемах радиоавтограмм цитоплазма и ядро, несущие нуклеоплазмин, показаны красным.через один ядерный поровый комплекс, если ядро содержит 3 000 ядерных пори делится раз в день?12.11. Структуры Ran-GDP и Ran-GTP (точнее, Ran-GppNp, стабильного аналога GTP) значительно отличаются друг от друга, как показано на рис. Q12.2. Неудивительно, что Ran-GDP и Ran-GTP связываются с разными наборами белков.Чтобы наблюдать вход Ran в ядро проницаемых клеток, к боковым цепямцистеинов Ran присоединяют красную флуоресцентную метку.
Такой модифицированный Ran поддерживает нормальный ядерный импорт. ФлуоресцентныйRan-GDP захватывается ядром только при добавлении цитоплазмы, тогда как егомутантная форма, RanQ69L-GTP, не способная гидролизовать GTP, не проходитв ядро как в присутствии цитоплазмы, так и в ее отсутствие. Для идентификациицитоплазматического белка, необходимого для захвата Ran-GDP, вы разрабатываетеаффинные колонки со связанным Ran-GDP или RanQ69L-GTP и пропускаете черезних цитоплазму. Цитоплазма, пропущенная через колонку с Ran-GDP, большене поддерживает импорт в ядро, тогда как цитоплазма, пропущенная через колонку с RanQ69L-GTP, сохраняет эту способность. Вы элюируете связанные белкииз каждой колонки и анализируете их на ДСН-полиакриламидном геле, пытаясьнайти отличия, которые позволят обнаружить фактор, необходимый для захватаRan ядром (рис. Q12.3).а.
Почему в этих экспериментах вы используете RanQ69L-GTP вместо Ran-GTP? РазвеРис. Q12.2. Структуры Ran-GDP и Ran-GppNp (задача 12.11).Красным показан участок Ran, наиболее сильно различающийся у белков, связанных с GDP и GTP.1266Часть IV. Внутренняя организация клеткиРис. Q12.3. Белки, элюированные из аффинных колонок Ran-GDP (дорожка 1)и RanQ69L-GTP (дорожка 2) (задача 12.11). Молекулярные веса белковыхмаркеров показаны слева.
(Из K. Ribbeck et al., EMBO J. 17: 6587–6598, 1998.С любезного разрешения издательства Macmillan Publishers Ltd.)Ran-GppNp на месте RanQ69L-GTP не позволил бы достичьтех же результатов?б. Какой из множества белков, элюированных с двухразных колонок, является наиболее вероятным кандидатомв факторы, способствующие ядерному импорту Ran-GDP?в. Предскажите один или несколько белков, с которымифактор импорта Ran-GDP мог бы связываться для выполнениясвоей функции.г. Как вы можете подтвердить, что идентифицированныйвами фактор необходим для входа Ran в ядро?12.12.
Компонентов комплекса TIM, мультисубъединичного белкового транслокатора внутренней мембраны митохондрий, значительно меньше, чем компонентов комплекса TOM. Для их идентификации пришлось прибегнуть к генетической уловке. Ген дрожжей Ura3, чейпродукт в норме локализован в цитозоле, где он необходим для синтеза урацила,модифицировали: к нему присоединили сигнал импорта в матрикс митохондрий.Популяцию клеток, несущую модифицированный ген Ura3, выращивали в отсутствие урацила. Большинство клеток погибло, но показали, что немногочисленныевыросшие клетки дефектны по митохондриальному транспорту. Объясните, кактакая селекция позволяет идентифицировать клетки с нарушениями компонентов,необходимых для митохондриального импорта. Почему нормальные клетки с модифицированным геном Ura3 не растут в отсутствие урацила? Почему клеткис дефектным митохондриальным импортом растут в отсутствие урацила?12.13. Если фермент дигидрофолатредуктазу (ДГФР, DHFR), в норме локализированную в цитозоле, модифицировать, присоединив к ее N-концу сигналтранспорта митохондрий, она эффективно импортируется в митохондрии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
