Lenindzher Основы биохимии т.3 (1128697), страница 44
Текст из файла (страница 44)
27-32). Третьим достижением стала разработка методов клонирования ДНК (гл. 30), которые сделали возможным получение достаточно больших количеств чистых генов — исходного материала для секвенирования. Было предложено два принципиальных подхода к секвенированию ДНК, у каждого из которых есть ряд вариантов. Фредерик Сэнгер, первым определивший аминокислотную последова- тельность белка, а именно инсулина (разд. 6.8), стал также первым ученым, установившим нуклеотндную последовательность в молекуле ДНК (бактериофага фХ174); произошло это в 1977 г.
Сэнгер и его коллеги разработали очень изящную процедуру-метод терминации цепей, или, как его еще называют, «плюсминусв-систему. Независимо от них Алан Максам и Уолтер Гилберт из США предложили несколько другой подход, получивший название химического метода. В обоих подходах используются фрагменты, полученные при расщеплении исходной ДНК с помощью рестриктнрующих эндонуклеаз.
В дополнении 27-1 описаны принципы метода определения нуклеотндной последовательности, разработанного Максамом н Гилбертом. 888 чАсть Ра мехАнизмы пеРеДАчи Генетической инФОРЫАЦии В этом наборе фрагментов меченый 5'-концевой остаток показан на красном фоне. Обратите внимание на то, что два фрагмента помечены, а это значит, что они содерхоат 5'-конец исходного олигонуклеотида, в то время как фрагменты Т вЂ” А — О, А — Π— С вЂ” Т вЂ” А — О и А — О не содержат метки, т.е.
в них отсутствует исходный 5'-конец. Нас будут интересовать только меченые фрагменты. Вторую порцию исходного меченого олигонуклеотида подвергают другой химической обработке, в результате которой вьпцепляются только остатки О, что приводит к обраэованюо другого набора меченых фрагментов (рис. 1). Такую же обработку претерпевает и третья порция исходного меченого олигонуклеотида, который фрагментируется в результате выщепления только остатков А. Аналогичным образом, четвертую порцию расшепляют благодаря удалению только остатков Т. В конце концов имеют четыре различные смеси меченътх фрагментов, полученные с помощью четырех разньгх химических процедур (рис.
1). Каждую из четырех смесей фрагментов подвергают электрофорезу на пластинке геля в условиях, обеспечивающих разделение фрагментов в соответствии с числом содержащихся в них нуклеотидных остатков независимо от того, какие это остатки. Прн таком разделении фрагменты будут двигаться тем быстрее, чем они меньше. Точное положение каждого меченого фрагмента в геле определяют радиоавтографией. Положения меченых фрагментов в каждом нз (н — А-т — с — А — о — с — т — А-а / Воллан»сапе Вмщеплепне Вмщепжнве Вмцщ»лемм сстнткса С св с остатков А т И() — А — т — с — А — с рй —.А — т-с — А — Π— с — т — А (и) — А — т — с — А-о-с — т 8й» вЂ” А — т — с — А — с — с И))- А — Т 8й — А — Т вЂ” С вЂ” А й()-А — т — с В( А Элек црсфсрстнмелнм разде»вняв Члено яр»лес»вдов в нефов м па»одящемся в 7 Гкаянпесм полевении) е данном с»раве дка манаева фрагмента состоят нв тре» н масте сота тюв 3 Нвпрвалснле две»евка Вмеодм: Остатки б н 7 О бегб Остатке х,б п Э представ лящт предсгавщщт праастаеллщт бдс асд с габон А такща оправам определена послемщателвнсслв фрвпиентщ йа-А — т — с — А — о — с — т — А-с пэллбтаеж Остатки 3 н б препотаелящт щгщб Т ГЛ ЕХ ДИК: СТРУКТУРА ХРОМОСОМ И ГЕНОВ 889 вариантов расщепления показаны на рис.
1. Положения немеченых фрагментов при этом не обнаруживаются, но эти фрагменты и не нужны для расшифровки последовательности. На рис. 1 результаты первого способа фрагментации, в котором выщеплялись остатки С, сопоставлены с электрофоретической картиной, показывающей расположение полученных при этом способе фрагментов длиной от 1 до 1О остатков. Злесь было обнаружено два меченых фрагмента.
Очевидно, это именно те фрагменты, которые содержат 5'-конец исходного олиюнуклеотида. Меченые фрагменты найдены в положениях, соответствующих олигонуклеотндам длиной в три и шесть остатков. Ясно, что в исходном нуклеотиле после этих меченых фрагментов в нацравленин к 3'-концу стоял остаток С, поскольку в химической процедуре, приведшей к расщеплению исходного олигонуклеотида, выщеплялся только этот остаток. Таким образом, в результате первой химической обработки мы узнали, что в положениях 4 и 7 (отсчитывая с 5'-конца) исходного олигонуклеотида должны располагаться остатки С. Теперь точно так же поступают с тремя другими наборами фрагментов, полученными в результате специфического вьшчепления соответственно остатков О„А и Т из исходного олигонуклеотнда (рис. 1). На схеме мы видим, что меченые фрагменты, полученные при выщеплении остатков О, движутся со скоростью, соответствующей олигонуклеотидам длиной в 5 и 9 нуклеотидных звеньев; таким образом, остатки 6 и 10 в исходном олигонуклеотиде должны быть О.
Из третьего набора фрагменточх полученного удалением А. следует, что в положениях 2, 5 и 9 были остатки А; четвертый набор фрагментов, полученный выщеплением остатка Т, указывает на присутствие остатков Т в положениях 3 и 8. В нижней части рис. 1 дана нуклеотидная последовательносп, установленная с помощью этой простой процедуры и некоторых рассуждений. Этим методом часто быстрее чем за 2 дня может быть определена нуклеотидная последовательность олигонуклеотидов, содержащих 200 и даже большее число остатков. Чтобы расшифровать нуклеотидную последовательность целой молекулы ДНК, сначала ее фрагментируют с помощью рестрикгирующей эндоиуклеазы. Затем каждый из образовавшихся фрагментов секвенируют по отдельности чю схеме, приведенной на рнс. 1.
Во второй аликвоте исходную ДНК расщепляют в других местах, используя другую рестриктнрующую эндонуклеазу, и получают второй набор фрагментов. После того как секвенирование всех фрагментов второго набора завершено, сравнение двух наборов дает возможность найти участки перекрывания, необходимые для сборки фрагментов первого набора в правильном порядке. В результате может быть установлена нуклеотндная последовательность интересующей нас природной ДНК.
Иногда, для того чтобы устранить неясности в некоторых участках последовательности, оставшиеся после первых двух расшепленн!Ь приходится анализировать третий нли четвертый наборы фрагментов. зчо члстыц мяхлнизмы пввидлчи гвнятичиской инеогмлции Краткое содержание главы Роль ДНК как носителя генетической информации подтверждается целым рядом фактов Эксперимент Эвери, МакЛеода и Мак-Карти показал, что ДНК, выделенная из одного штамма бактерий, способна проникнуть в клетки другого штамма и трансформировать их, придавая им некоторые наследуемые признаки донора Опыт Херши и Чейз продемонстрировал, что именно ДНК бактериофага, а не его белковая оболочка несет генетическое сообщение для репликации вируса в клетке-хозяине.
Все соматические клетки организма данного вида содержат ДН1' с одинаковым нуклеотияным составом, который не зависит ни от цитання, ни от условий окружающей среды. Хотя нуклеотидный состав ДНК у разных видов различен, в двухцепочечных ДНК всех видов число остатков аленина всегда равно числу остатков тимина, а число гуаниновых остатков всегда равно числу цитозиновых остаткоа На основании рентгеноструктурного анализа волокон ДНК и принципа комплементарности оснований в ДНК Уотсон и Крик пришли к заключению, что нативная ДНК состоит из двух аитижраллельных цепей, скрученных в двойную спираль. Комплементарные основания А — Т и С вЂ” С образуют с помощью водородных связей пары внутри спирали, а гцлрофильный сахарофосфатный остов располагается с наружной стороны макромолекулы. Пары оснований плотно уложены в стопку перпендикулярно длинной оси на расстоянии 0,34 нм друг от друга; на один полный виток двойной спирали приходится приблизительно 10 нуклеотидных пар оснований.
Комплементарность цепей в двойной спирали позволяет понять механизм их точной репликации. При нагревании или при экстремальных значениях рН нативная ДНК обратимо расплетается и ее цепи разделяются. Поскольку пары оснований О== —.С более стабильны, чем пары А=Т, точка плавления ДНК, богатой парами О===.С, выше точки плавления ДНК с большим содержанием пар А=Т. Денатурированная одноцепочечная ДНК из одного нида может образовать тибрндньш дуплекс с денатурированной одноцелочечиой ДНК из другого аида при условии, что нуклеотидные последовательности этих двух цепей имеют хотя бы некоторое сходство 1гомологию). На основании эффективности образования таких гибридов судят о возможном родстве разных видов н о гомологии между ДНК и РНК.
У ДНК-содержащих вирусов бактерий единственная двухцепочечная молекула ДНК может быть либо замкнутой в кольцо, либо линейной; некоторые вирусные ДНК, например ДНК фХ174; это одноцепочечные молекульь Вирусные ДНК сверхспирализованы, что облегчает их платную упаковку внутри вириона. Единственная хромосома бактерий представляет собой значительно больший по размеру, ковалентио замкнутый кольцевой дуплекс. Бактериальная ДНК свернута с образованием большого числа цетель, каждая из которых сверхспирализована Эукариотические клетки содержат много хромосом, причем каждая хромосома представляет собой одну очень длинную линейную молекулу ДНК, в 4 — 100 раз превосходящую по длине единственную хромосому прокариот. Эукариотическая ДНК обматывает белковые частицы, состоящие из нескольких молекул основных белков — гистонов, которые располагаются вдоль ДНК через определенные интервалы.
Такие комплексы участков ДНК и гистонов называются нуклеосомами, Структурные гены — зто участки ДНК, которые кодируют полипептидные цепи, тРНК и рРНК. Вирусные ДНК содержат сравнительно небольшое число генов в отличие от ДНК Е. со11, содержащей более 3000 генов. К настоящему времени расположение многих из них в кольцевой хромосоме уже установлено. Бактерии защищают свою собственную ДНК путем метилирования некоторых оснований, расположенных в определенных местах молекулы, с помощью модифицирующих метнлаз. При ГЛ. 27.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
