Lenindzher Основы биохимии т.3 (1128697), страница 48
Текст из файла (страница 48)
28.6. Для действии ДНК-полимеразы необходима предсуществующая ДНК Корнберг и его коллеги, изучая вопрос о том, зачем ДНК-полимеразе необходимо присутствие ДНК, нашли, что эта ДНК выполняет в полнмеразной реакции две важнейшие функции — она служит затравкой и матрицей. 1ИИИИИИ Гл 28. Рнпликдция и тРАнскрипния днк 90! ствующую цепь, причем даже зто она мо- жет делать только в присутствии цепи, играющей роль матрицы. ! ΠΠ— Р=-О о 6.
Другая цепь предсуществующвй ДНК служит матрицей Нуклеотиды присоединяются к цепи- затравке в соответствии с нуклеотндной Рнс ха~а цепь днк о н ! Π— Р=О Направление роста о вправление сикхе'зв Свободный 3 -гилраксильныв он н конец ;1. у у Π— Р— Π— Р— Π— Р— О о о з'ГН Нпвые вуклеотиды присоединяют ся к 8 -жшцу затравки Псстуваюиий Дезоксирибо- нуклеозид-б- трнфасфат Спаренные основания О О' НΠ— Р— Π— Р— О' О О Пирафосфат он н Пель Пель ~~~рицы затравки Рис. 28-7. Идланенне пепи ДНК с помпшью ДНК-лолимеразы. Новая межнуклеотидная связь образуется в результазе нуклеофнльной атаки свободной Зсгнлроксильнай группой ато- ма фосфора, нахопшпегося в а-положении при- соедиияюшегося дезоксирибонуклеозидтрифос- фата.
В ходе реакции высвобо:кдается пиро- фосфат. Полинуклеопшная цепь ДНК-матрицы иа рисунке не показана. Рнс. 28-8. Сзруктура прелсушествуюшей двух- ценочечнай ДНК, которая требуется для дей- ствия ДНК-полимеразы. Длв таза чтобы шел синтез, нужна одиночная неснаренная цепь, ко- зорая служит матрицей. Кроме таза. неабхо- лима присутстние пепи-затравки. к которой прнсаелинкются новые нуклеотидиые звенья. последовательностью цепи-матрицы по принципу комплементарного спаривания Уотсона — Крика.
Где бы ни находился в матричной цени остаток тимина. в дочерней цепи в зтом месте встраивается остаток аденина, и наоборот. Аналогичным образом, если в цепи-матрице стоит остаток гуаннна, то напротив него в дочерней цепи будет встроен остаток цнтозина, и наоборот. Таким образом, продукт ДНК-полимеразной реакции— это дуплекс с комплементарно спаренными основаниями. На рис. 28-8 схематиче- а.
Одна из цепей предсуществующей ДНК служит затравкой ДНК-полимераза последовательно добавляет нуклеотиды к Зиконцу одной из цепей, служащей затравкой. Следовательно„синтез новой цепи ДНК происходит в направлении 5'- 3'. ДНК-полимераза не в состоянии сама по себе без затравки начать синтез новой ДНК; она способна только удлинять уже суше- 902 чАСТь 1У.
МЕХАниЗМЫ пЕРЕПАЧи ГЕНЕТИЧЕСКОН НИФОРМАПии ски показано, какую роль играет в ДНК-полимеразной реакции предсушествуюшая ДНК. Поскольку ДНК-полимеразе необходимы как цець-затравка, так н свободная цепь-матрица, этот фермент не способен осуществлять репликащпо целой нативной хромосомы, если последняя является двухцепочечным кольцом, одноцепочечным кольцом или интактным линейным дуплексом, в котором спарены все основания, В связи с обязательным требоынием для работы ДНК-полямеразы затравки и матрицы возникло много принципиальных вопросов относительно инициации и элонгации синтеза цепей ДНК. 28.7.
Д рыциш ц ДНК требуется много ферментов и белковых факторов Ранние исследования Корнберга н его коллег открыли путь к прямому изучению репликации ДНК, однако и по сей лень у нас нет полной и детальной картины процесса репликации, даже в случае вирусной ДНК, образующей всего лишь одну небольшую хромосому. Сегодня благодаря усилиям Корнберга н многих других исследователей мы знаем, что для репликации необходима не только ДНК- полимераза. В этом процессе, по-видимому, участвуют больше двадцати различных ферментов и белков, каждый нэ которых выполняет определенную функцию.
Репликация состоит из большого числа последовательных этапов, которые включают узнавание точки начала репликации, расплетание родительского дуплекса, удергкаиие его цепей на достаточном расстоянии друг от друга„инициацию синтеза новых дочерних цепей, их элонгацию, закручивание цепей в спираль и, наконец, терминацию репликации. Все эти этапы процесса репликации протекают с очень высокой скоростью и исюпочительной точностью. Весь комплекс, состоящий более чем из двадцати репликативных ферментов и факторов, называют ДНК-репликаэгюй сисвымой, или реллисомой. Рассмотрим в общих чертах основные этапы процесса репли- кации в том виде, в каком они известны нам иа сегодняшний день.
28.8. В клетках Е. сой присутствует три ДНК-полимеразы Таблица 28-1. ДНК-полнмераэы Е, сойо 1П ! и Каталиэируемая активность 5' ~ 3'-полимераэнаи + 5' -г 3'-экэоиухлеаэнаи + 3' - 5"-эхэоиуклеаэиая + Молекулярная масса 109000 Число молекул фермента в расчете иа клетку 400 Активность (число присоединяемых иухлеотилов эа минуту в расчете яа одну молекулу при 37'С) 600 + + 120000 400000 10 30 9000 " Иэ книги: А.
Капгьега ОНА Керхсепеп, Ргееипэп, Бее Ргепсисе, 1980, р. 188. Клетки Е. сой содержат три различных ДНК-полимеразы, обозначаемые 1, П и 1П (табл. 28-1). Наиболее широко распространенная из иих-зто ДНК-полимераза 1, тот фермент, который был описан выше. Хотя Корнберг показал, что этот фермент способен реплицировать в пробирке целую молекулу ДНК мелкого вируса фХ174 с образованием биологически активной дочерней ДНК, мы знаем, что ДНК-полнмераза 1-это не главный фер. мент, осуществляющий элонгацию ДНК в клетке. ДНК-полимераза 1 действительно принимает участие в репликации, но, как мы увидим позже, особым образом.
В иитахтньгх клетках Е. сей за элонгашгю цепи ДНК отвечает главным образом ДНК-полимераза П1. Она фуикцио- ГЛ. 28. РЕПЛИКАЦИЯ И ТРАНСКРИПЦИЯ ДНК Рис, 2$-К Холофермент ДНК-полимеразы Ш. Он состоит нз собстаенно полимеразы (субт едииипе о) и ряда других субъединигт ннрует в форме большого комплекса с мол. массой 550000, называемого холоферментом ДНК-полимеразы П1 (рис. 28-9).
Этот комплекс содержит в своем составе ион Хпз+ и требует для работы наличия ионов Мбз+. Ему также необходимы матрица и затравка, без которых он не может инициировать процесс репликации. Подобно ДНК-полимеразе 1, он удлиняет ДНК в направлении 5' 3; присоединяя новые нуклеотиды к 3'-концу цепи-затравки. Холофермент состоит из нескольких субъединиц.
Субьединица б, или кополимерзза 1П, необходима для узнавания и связывания цепи- затравки, роль которой выполняет родительская ДНК. Как только холофермент присоединяется к правильному месту инициации, кополимераза 1П высвобождается из комплекса. Элонгацню цепи дочерней ДНК осуществляет оставшийся комплекс ДНК-полимеразы П1. Оба фермента-ДНК-полимераза 1 и ДНК-полимераза П1-обладают тремя ферментативными активностями.
Кроме полимеразной активности они имеют 5'- 3'- и 3" - 5'-зкзонуклеазные активности, т.е. они могут отщеплять концевые нуклеотиды с любого конца цени ДНК. Позже мы увидим, в чем смысл зкзонуклеазных активностей ДНК-полимераз. Функция ДНК-полимеразы 11 пока неизвестна. Теперь рассмотрим некоторые проблемы, которые возникают при формировании наших представлений о репликацни ДНК. 28.9. Одновременпвв репликвции обеих цепей ДНК создает проблемы Одна из проблем связана с тем, что ДНК-полимеразы способны присоединять новые мономеры только к 3'-концу ДНК.
Мы уже видели, что при репликации хромосомы Е. соб обе цепи в месте нахождения репликативной вилки реплицируются одновременно. В то же время мы знаем, что в двухцепочечной ДНК цепи антипараллельны. Это означает, что рост лочерних цепей также должен происходить антипараллельно.
В репликативной вилке находятся 3'-конец одной растущей цепи и 5'-конец другой. Из того что ДНК-полимераза может присоединять нуклеотиды только к 3'-концу и не может присоединять их к 5'-концу, следует, что ДНК-полимераза способна удлинять только одну из двух растущих цепей в направлении движения репликативной вилки. Тогда возникают вопросы. Быль может, существуют два класса ДНК-полимераз, и представители одного из них присоединяют остатки только к 3'-концу, а другого-только к 5'-концу? Илн же существует такая ДНК-полимераза, которая может удлинять цепь как с 5'; так и с Зсконца? Илн же, наконец, одна из цепей реплицируется ферментами, движущимися в направлении, противоположном направлению движения репликативной вилки? 28.10. Открытие фрагментов Оквзвки Ответ иа все зги вопросы дало важное наблюдение, сделанное Рейджн Оказаки из Японии, который обнаружил, что в ходе реплнкации ДНК Е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
