Э. Рис, М. Стернберг - Введение в молекулярную биологию от клеток к атомам (1128690), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Длительность фазы G2 примерно2—6 часов и относительно слабо зависит от типаклеток. В фазе G2 происходит конденсация хроматинаи исчезает ядерная мембрана. Между G2 и М клеткапроходит состояние профазы.В профазе высококонденсированные хромосомына самом деле оказываются состоящими из двух переплетенных, но раздельных структур, называемых хроматидами. Каждая хроматида — это завершенная копия двухцепочечной ДНК в комплексе с белками. Вовремя профазы центриоли, которые ранее поделилисьс образованием меньших, дочерних, центриолей, расходятся к противоположным полюсам.
Виден сложный пучок микротрубочек (гл. 39), выходящих из центриолей, который называется митотическимверетеном. Оно образовано микротрубочками, распо-ложенными между центриолями, и по форме напоминает яйцо. Эта структура выполняет в клетке функцию строительных лесов. Когда клетка входит в митоз, хромосомы связываются с «лесами», а ядернаямембрана перестает быть видимой. Хромосомы прикрепляются к микротрубочкам своими центромерами.Митоз (М) подразделяется на три периода: метафазу,анафазу и телофазу.В метафазе хромосомы выстраиваются поперек митотического веретена, образуя метафазную пластинку.Механизм, лежащий в основе этой ориентации, неизвестен.В анафазе хромосомы разделяются на составляющиеих хроматиды.
Каждая из хроматид от каждой парыдвижется к тому или другому концу митотического веретена. Движение хроматид, называемых теперь дочерними хромосомами, обусловлено сокращениеммикротрубочек, но детальный механизм этого процесса неизвестен. После завершения разделения хроматид клетка входит в телофазу.В телофазе хроматиды деконденсируются, образуядисперсный хроматин, и формируются ядерные мембраны. Митотическое веретено разрушается, а плазматическая мембрана перетягивается.
В результатеполучаются две дочерние клетки. Затем каждая дочерняя клетка переходит в новый клеточный цикл в фазеGo или G1, и весь процесс повторяется.30. Генная инженерия:клонирование геновКлонирование генов – это процедура, включающаявыделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- или эукариотических. Этиклетки, содержащие нужный нам ген, можно использовать для получения либо а) большого количествабелка, кодируемого данным геном, либо б) большогоколичества самого гена в высокоочищенном виде. Внастоящее время используют две схемы клонирования гена. Согласно первой из них, геномную ДНКсначала расщепляют случайным образом с помощьюрестрицирующих эндонуклеаз (см.
ниже) на небольшие фрагменты примерно такой же длины, что и ген.Далее каждый фрагмент вводят с помощью вектора вреципиентную клетку, которая затем размножается,амплифицируя при этом ген или гены, содержащиесяв данном фрагменте. К этой методике мы больше возвращаться не будем. Согласно второй схеме, с инфор-мационной РНК, выделяемой из однотипных клетокорганизма, снимают ДНК-копии (кДНК), которыезатем вводят в реципиентные клетки, в среднем по одному гену на клетку, и амплифицируют тем же способом, что и в первом случае.Реципиентные клетки, т.е.
клетки, выбранные дляклонирования гена, могут быть как про-, так и эукариотическими. Чаще всего для этой цели используютбактерии, поскольку их легко получать в большом количестве. Если, однако, ген был выделен из клетокмлекопитающих по первой методике, то его нужноклонировать в клетках эукариот, например в клеткахдрожжей, из-за неспособности ДНК, содержащей интроны (гл. 27), экспрессироваться в прокариотической клетке. Рассмотрим теперь вторую методику.Матричную (информационную) РНК (мРНК) выделяют изклеток или тканей, в которых экспрессиру-ется искомый ген. Так, для клонирования проинсулинового гена следует использовать (3-клетки поджелудочной железы, так как именно для них характерновысокое содержание проинсулиновой мРНК. Суммарную клеточную мРНК с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы можно разделить на фракции, впрочем, довольно сильно перекрывающиеся.При такой грубой очистке число посторонних молекул мРНК в препарате уменьшается.
Затем с молекулмРНК, попавших в нужный нам диапазон молекулярных масс (для белка таких размеров, как проинсулин,длина соответствующей молекулы мРНК составитпримерно 25 000 нуклеотидов, или 25 т.п.н.), снимаются ДНК-копии.Синтез ДНК - копий осуществляется ферментом,называемым обратной транскриптазой, или ревертазой (еще одно его название — РНК-зависимая ДНКполимераза), который выделяют обычно из соответствующих РНК-содержащих вирусов.
Чтобы этотфермент начал работать, требуется короткая (около 10нуклеотидов) одноцепочечная ДНК-затравка; дляэтой цели, как правило, используют oligo(dT). Затравочная ДНК самопроизвольно образует двухцепочечный комплекс с отрезком poly(dA), который всегдаприсутствует на З'-конце молекул эукариотическоймРНК (гл. 22).
По завершении стадии копированияисходную цепь РНК разрушают (деполимеризуют).ДеполимеризациюисходнойРНК-цепочкиосуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНКустойчивы к обработке щелочью, а РНК полностьюде-полимеризуется. Получившаяся в результате ДНКявляется одноцепочечной (оц), лишь на конце молекулы образуется «шпилька» с небольшой петлей. Такая шпилька образуется потому, что на 5'-конце большинства мРНК имеется последовательность, однаполовина которой комплементарна другой (палиндром) и которая в результате копирования оказывается и в кДНК.
Таким образом, концевой участок цепочки кДНК, где расположена эта последовательность,может замыкаться сам на себя с образованием петли иотрезка двойной спирали.Двухцепочечную (дц) кДНК получают путем достраивания оц-кДНК до двухцепочечной формы, выполняемого ферментом ДНК-полимеразой I. Для тогочтобы этот фермент функционировал, также в принципе требуется затравочная ДНК, однако здесь еевполне заменяет короткий отрезок двойной спирали,образуемый шпилькой. На одном из концов такой дцкДНК все еще остается одноцепочечная петля; онаудаляется с помощью фермента нуклеазы S1.
Этотфермент разрезает петлю и, кроме того, подравниваетцепочки ДНК, удаляя всю оставшуюся оц-ДНК. После такой обработки кДНК можно встраивать в вектор.Вектор - это нечто вроде молекулярного «такси»,способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она могла тамреплицироваться. Существует два основных типа век-торов: бактериальные плазмиды и бактериофаги.Здесь мы рассмотрим только первый тип.Плазмиды — это встречающиеся в клетках внехромосомные элементы, представляющие собой замкнутыекольцевые молекулы дц-ДНК (гл. 26). Они способныреплицироваться независимо от геномной ДНК бактерий. Часто плазмиды содержат гены, белковые продукты которых обеспечивают нечувствительность к тем илииным антибиотикам. Этим свойством пользуются дляотделения бактерий, содержащих плазмиды («+»-бактерии), от «—»-бактерий, лишенных плазмид.
Чтобывключить кДНК в плазмиду, замкнутое кольцо плазмиды надо «разомкнуть». Для этого плазмиды подвергаютвоздействию рестриктаз.Рестриктаза - (гл. 18) разрезает дц-ДНК поопределенным нуклеотидным последовательностям,называемым участками рестрикции (обычно этокороткие па-линдромные последовательности); разныерестриктазы узнают разные палиндромы. В плазмидах,встречающихся в природе, часто бывает много такихучастков для каждой из рестриктаз.
Поскольку видеальном случае нам нужна одна-единственная точкаразреза, есть смысл в направленном отборе или«конструировании» плазмид с таким свойством.Например, в плазмиде pBR322, широко используемойв качестве вектора, для многих рестриктаз имеется лишьпо одному участку рестрикции; в ней также имеютсягены, обеспечивающие резистентность к ампициллинуи пенициллину; и в ней нет некоторых«несущественных» генов, имевшихся в ее прототипе.Оставлены лишь те гены, которые необходимы дляосуществления функций трансформации бактерий ирепликации плазмиды.Сшивание (лигирование) — процедура, в ходе которойчужеродная ДНК встраивается между (или сшиваетсяс) двумя концами плазмидной ДНК с помощьюфермента, называемого ДНК-лигазой.
Чтобы эта операция могла осуществиться, необходимо, чтобы концы кДНК и плазмидной ДНК были «липкими». Дляэтого на концах должны быть оц-последовательности,способные образовывать комплекс друг с другом черезспаривание оснований и обеспечивающие сцеплениедвух пар концов. Так образуется плазмида, котораяназывается рекомбинантной. Описываемая ниже процедура, с помощью которой это достигается, называется методом гомополимерных концов. Существует ещеодна процедура, называемая связыванием по сайтамрестрикции, но мы ее рассматривать не будем.Метод гомополимерных концов основан наприсоединении к 3'-концам цепей, образующих дцДНК, коротких отрезков оц-ДНК с регулярнойпоследовательностью(гомополимерных).Есликаждый подобный гомополимер состоит изнуклеотидов одного вида и если два такихгомополимера с взаимно комплементарнымиоснованиями присоединены соответственно кплазмиде и к кДНК, то последние, оказавшись рядом,замкнутся друг на друга с образованиемрекомбинантной плазмиды.Трансформация происходит после того, как рекомбинантную плазмиду добавляют к бактерии-реципиенту: плазмида проникает внутрь бактерии и включается в ее жизненный цикл.
Поскольку не всебактериальные клетки в реакционной смеси будуттрансформированы, желательно провести их отбор, стем чтобы размножаться могли лишь рекомбинантные бактерии. Отбор может быть основан на том, чтоплазмиды обеспечивают резистентность к тем илииным антибиотикам. Это означает, что только те бактерии, в которых есть плазмиды, будут размножатьсяв присутствии соответствующего антибиотика.Скрининг («просеивание») — это процедура,необходимость применения которой обусловлена тем,что в исходном препарате кДНК представлено многоразных мРНК и лишь часть плазмид несет нужныйнам ген. Методики, которые при этом используются,слишком специальны, и мы не будем их здесь рассматривать; подробное описание их имеется в приложен-ных ссылках.
Как только нужную нам бактерию удалось выделить, ее нетрудно клонировать и размножить в культуре. Это уже содержание следующего этапа, называемого амплификацией.Амплификация осуществляется благодаря тому,что в одной бактериальной клетке можетсинтезироваться много копий интересующей насплазмиды, а также за счет получения большогоколичества клеток с такими плазмидами. Послевыделения и очистки плазмиды обрабатываютсоответствующей рестриктазой, которая вырезаетвстроенные в них копии искомого гена. Амплифицированный таким образом ген можно использовать для дальнейших экспериментов в области геннойинженерии, аналогичных тем, что упомянуты в спискерекомендуемой литературы.
Кроме того, бактерииможно применять для получения белкового продуктагена, встроенного в плазмиду, если выполняются дваусловия: а) происходит транскрипция этого гена иб) нужный белок секретируется бактерией.31. Структура полисахаридовПОЛИСАХАРИДЫ — это длинные цепочки из моносахаридов, соединенных гликозидными связями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
