А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын - Физика белка - Курс лекций с цветными и стереоскопическими иллюстрациями и задачами (1123404), страница 74
Текст из файла (страница 74)
Предположим, мы хотим ввестив структуру белка какой-то сайт или просто стабилизировать эту структуру(на рис. 23-6, в качестве простого примера, изображено введение сайтаAsp — His, часто встречающегося в активных центрах белков). тогда,во-первых, мы ищем в банке «старых» белков (структура которых ужеустановлена рентгеном или ЯМр) тот белок и те аминокислотные остаткив нем (на рисунке — Z и Y), которые, после замен Z→Asp и Y→His,могут дать искомый сайт с искомой конфигурацией Asp и His. Затемв гене выбранного «старого» белка мы заменяем кодоны, кодирующие Zи Y, на кодоны, кодирующие Asp и His, соответственно, — и получаемген «нового» белка, содержащего искомый сайт (а после, конечно, надоеще проверить, работает ли этот сайт, и узнать — при помощи рентгенаили ЯМр — получился ли он в нужной конфигурации).Рис.
23-6. схема применения белковой инженерии для «прививки» к белкунового функционального сайта. картинка, с некоторыми упрощениями, взята из:Финкельштейн, Биополимеры и клетка (1989) 5:89–93343 то, что я показал на рис. 26-6, — не более, чем простой учебныйпример. А вот как была построена замечательная работа группыдэвида Бейкера, в которой им удалось создать (Röthlisberger et al., Nature (2008) 453:190–195) не существовавший в природе активный центрдля не существовавшей в живых организмах химической реакции.В качестве таковой была взята «элиминация кемпа» — перенос протонас одного отростка ароматической молекулы на другой.
Выбор типаи конфигурация функциональных групп, способных катализироватьтакую реакцию, а значит — стабилизировать переходное состояниена ее пути, был сделан, исходя из физики и химии процесса элиминации(кстати, для этого катализа оказалась пригодной, наряду с рядом других,и определенная конфигурация рассмотренной выше диады Asp — His,лежащей в кармане из ароматических боковых групп). далее, быливыбраны (при помощи уже упомянутого комплекса программ Rosetta) те белки, к которым можно привить выбранную диаду в требуемомокружении и требуемой конфигурации. Затем эта прививка была сделанаметодами генной инженерии, белок был экспрессирован, и оказалось,что полученный искусственный фермент ускоряет элиминациюкемпа в миллион раз по сравнению со скоростью ее спонтанногопротекания (что очень и очень неплохо для начала, хотя некоторыеприродные ферменты ускоряют реакции в миллион миллионов раз);а рентгеноструктурный анализ показал, что привитой активный центрвыглядит практически так, как того требовал теоретический дизайн.Итак, дело было сделано — был получен искусственный ферментс запланированной, но не существовавшей до того в природе активностью.Белковая инженерия — это метод решения разных задач.
Ониспользовался и для выяснения вопроса о том, может ли одна и та же(или почти одна и та же) аминокислотная последовательность кодироватьдве существенно разные укладки белковой цепи. Оказалось — может, еслитщательно поработать над аминокислотной последовательностью.Группа Орбана и Брайана стартовала от двух белков, PSD1 и GB1,имеющих равную длину цепи, но разную структуру и функцию (рис. 23-7),и разные последовательности, в которых совпадали всего 9 остатков из 58(идентичность 15 % — это отвечает практически случайному сходству).далее, пошагово вводя в эти последовательности сближающие их другс другом мутации и на каждом шаге контролируя сохранение белкамиих первоначальных функций, Орбан и Брайан добились того, чтосохранившие и свои функции, и свои структуры (Alexander et al., Proc. Natl. Acad. USA (2007) 104:11963- 11968; He et al., Proc. Natl. Acad USA (2008) 105:1441214417) последовательности совпадали уже на 88 %, т.
е. у них было 51344идентичных остатков из 58 (см. рис. 23-7). дальнейшая работа над этимипоследовательностями уменьшила их различие — при сохранении различияих структур и функций — всего до 1 остатка (Alexander, He, Chen, Orban,Bryan, Proc. Natl. Acad. USA (2009) 106:21149–21154)!Рис. 23-7. Белки, сохранившие после введения множества мутаций своифункции и пространственные структуры, но приобретшие 88 %-ю идентичностьпоследовательностей.
Измененные остатки выделены цветом и скелетнымимоделями боковых групп на показанных в верхней части рисунка укладкахбелковых цепей. На показанных в нижней части рисунка последовательностяхсовпадающие аминокислотные остатки изображены заглавными буквами, аразличающиеся – маленькими (и подчеркнуты). рамкой обведен тот единственныйостаток, который, в пределе, различает эти белки, сохранившие свои структуры ифункции. картинка, с некоторыми упрощениями и дополнениями, взята из He etal., Proc. Natl. Acad. USA (2008) 105:14412–14417В другой интересной работе (Gambin, Schug, Lemke, Lavinder, Ferreon, Magliery, Onuchic, Deniz, Proc. Natl. Acad. USA (2009) 106:10153–10158) показано, что после целенаправленного введения несколькихмутаций белок, имеющий вид четырехспирального пучка, приобретаетвозможность находиться в другой конформации – также имеющей видчетырехспирального пучка, но с другой укладкой спиралей.
При этомодни условия среды стабилизируют одну структуру, другие – другую, а впромежуточных условиях обе структуры сосуществуют одновременно.345Итак, почти одна и та же или даже совсем одна и та же (но оченьхорошо отобранная!) аминокислотная последовательность может, впринципе, кодировать две существенно разные укладки белковой цепи. Едва освоив введение мутаций в «природные» белки, белковая инженерия обратилась к дизайну, конструированию белковых молекул. Задача дизайна — обратная по отношению к задаче предсказания структуры.
Если при предсказании мы должны найти пространственную структуру, наиболее пригодную для рассматриваемой последовательности, —то при дизайне мы должны найти, сконструировать последовательность,годную для создания желаемой пространственной структуры.Вообще говоря, расчет искусственных конструкций может быть проще, чем предсказание структуры «натуральных» белков (расчет прочности«искусственной» башни проще, чем «натурального» дерева: она спроектирована так, чтоб поддаваться расчету!).
А конструирование новых белковопирается на теорию белковых структур; их «строительными блоками»обычно служат последовательности, кодирующие мощные, внутренне стабильные и способные к эффективному слипанию α- и β-участки.Белковый дизайн был поставлен на повестку дня в конце 1970-х — начале 1980-х гг., когда возникла техника создания искусственных генов и техника точного химического синтеза белковых цепей. В конце 1980-х — начале 1990-х гг.
при помощи прикидок, проб и ошибок были созданыпростейшие белковые молекулы. Их архитектуры брались из природныхбелков, а их аминокислотные последовательности подбирались так, чтобы,не будучи гомологичными природным, стабилизировать эти архитектуры. Первым был сделан — в группе деГрадо — четырехспиральный пучок (рис. 23-8). дизайн проводился в тесном диалоге с экспериментом.Исследование окончательного варианта белка показало, что он спиралени глобулярен; и структура этого искусственного белка оказалась гораздостабильнее, устойчивее к нагреву, чем структура любого «естественного»белка! Потом, правда, оказалось, что этот белок не плавился при нагревании потому, что был расплавленной глобулой с самого начала… Пришлосьусилить твердую структуру этого искусственного белка, введя в него гистидины, связывающие ион.
И вот этот-то белок-комплексон оказался ужетвердым, как природные белки.долгое время все искусственные белки (кроме тех, что усиливались образованием ионных комплексов) представляли собой коллекцию отличныхрасплавленных глобул. Они обладали прекрасной вторичной структурой,они были очень компактны, но им не хватало твердости. Вопрос: почему хотят сделать нормальный, «твердый» белок — а получается расплавленная глобула?346Рис. 23-8. Основные этапыдизайна четырехспиральногопучка, сделанного в группедеГрадо. 1. Подбор короткихспиральных пептидов, способных слипаться в тетрамер. 2.дизайн петель, сшивающихэти пептиды попарно, и отбортех вариантов сшитых пептидов, что димеризуются.
3. дизайн последней петли и отбормономерного тетраспирального искусственного белка. рисунок W. F. DeGrado взят, с еголюбезного разрешения, из [6]Видимо, потому, что все знают, как сделать стабильные вторичныеструктуры (лейцины и аланины, отороченные глутаминовыми кислотамис N-конца и лизинами с с-конца — получится α-спираль; побольше валинов, изолейцинов и треонинов — получится β-структура); и все знают,как заставить эти α- и β-структуры слипаться: надо сделать на них сплошные поверхности из гидрофобных групп (рис. 23-9); и как заставить этибелки не агрегировать: надо сделать противоположные поверхности этихα- и β-структур из гидрофильных групп.
Но вот для чего рецептов поканикто не сделал — это для создания плотной упаковки боковых группв гидрофобном ядре белка. Вот эта-то упаковка и не получается. А без неепри наличии слипающихся, но не плотно слипающихся вторичных структур получается лишь расплавленная глобула… Чтобы справиться с недостаточной точностью методов расчета и дизайна, часто отходят от «рационального» конструирования и прибегаютк введению в цепь множества случайных мутаций (точечных или блочных,но — массовых!) с последующим отбором имеющих «белковоподобную» активность вариантов (скажем, специфически с чем-нибудь связывающихся). таким путем группе Н. райтона (N. Wrighton) удалось сделатьмини-белок (димер из двух β-шпилек), обладающий активностью гормонаэритропоиэтина.
(Интересно, что природный гормон состоит из 166 остатков, а его искусственный аналог — всего из 20!).347и М. П. кирпичниковым, положена структура, не обнаруженная еще в природе. Она состоит из двух повторов типа α-β-β (поэтому белок и названальбебетином), и она не противоречит общим принципам формированияструктуры глобулярных белков.структурное исследование альбебетина показало, что он обладает заданной вторичной структурой (рис.
23-11а) и компактной, весьма стабильнойк разворачиванию мочевиной и к протеолизу пространственной структурой. Однако он кооперативно не плавится и находится скорее в состояниирасплавленной глобулы, чем в твердом.Рис. 23-9. (а) структура исходного «цинкового пальца» (второго модуля белкаZif268); ион Zn показан шариком. (б) структура искусственного белка FSD-1. (в)спектр кд для FSD-1 при 1 °с. (г) Изменение спектра кд искусственного FSD-1с температурой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
