Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_3 (1123315), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Каждая цепь ДНК служит матрицей для синтеза новой цепи, при этом образуются две новые двухцепочечные молекулы ДНК, каждая из которых состоит из одной новой и одной старой цепей. Поэтому процесс называется полуконсервативной репликацией. Уотсон и Крик выдвинули гипотезу полу- консервативной репликации вскоре после публи- Выявгение даумаврааленного «арактера ревлилл~ни ДНИ...: э; .::,, р'г '; .-„: ° »:.еь:".. $5О! Часть|11. 25. Метаболизм ДНК одна фосфодиэфирная связь образуется из менее стабильного фосфоангидрида.
Нековалентные стэкинговые взаимодействия оснований и их спаривание обеспечивают дополнительную стабилизацию удлиняющейся ДНК по сравнению со свободными нуклеотидами. Кроме того, синтез ДНК приводит к высвобождению в клетке 19 кДж/моль энергии в результате последующего гидролиза пирофосфата под действием фермента пирофосфатазы (с. 38 в т.
2). Еще в ранних исследованиях ДНК-полимеразы ! удалось определить два основных условия, необходимых для полимеризации ДН К. Во-первых, все ДНК-полимеразы нуждаются в матрице. Реакция полнмеризации происходит на матрице ДНК согласно правилам комплементарности оснований, установленным Уотсоном и Криком: если в матрице присутствует гуанин, к новой цепи присоединяется дезоксинуклеотид цитозина и т. д. Это открытие имеет очень важное значение не только потому, что оно объясняет химическую основу точной полуконсервативной репликации ДНК, но и потому что это был первый пример использования матрицы лля проведения реакции биосинтеза.
Во-вторых, полимеразы нуждаются в праймере. Праймер — это участок цепи (комплементарный матрице) со свободной Зчгидроксильной группой, к которой может присоединиться нуклеотид. Иначе говоря, перед началом синтеза часть новой цепи уже должна существовать: все ДН К-полимеразы могут присоединять нуклеотиды только к уже существуюгцей цепи. Многие праймеры представляют со1юй олигонуклеотиды РНК, а не ДН К; специальные ферменты синтезируют праймеры там и тогда, где и когда они требуются.
После присоединения нуклеотида к растущей цепи ДНК ДНК-полимераза либо диссоциирует, либо продвигается вдоль матрицы и присоединяет следующий нуклеотид. Диссоциация и обратное присоединение полимеразы может ограничивать среднюю скорость полимеризации — процесс обычно протекает быстрее, если полимераза присоединяет нуклеотиды, не покидая матрицы. Среднее число нуклеотидов, присоединенных до диссоциации полимеразы, определяет ее процессивность. ДНК-полимеразы существенно различаются по процессивности; некоторые присоединян>т всего несколько нуклеотидов до диссоциации, другие присоединяют многие тысячи.
9 Полнмеризацня нуклеотндвв ДНН-полнмеразвй Реплнкацня — очень точный процесс Репликация осуществляется с исключительной точностью. У Е. сой происходит всего одна ошибка на каждые 10э — 10'" присоединенных нуклеотидов. Для хромосомы Е. сей, размер которой составляет примерно 4,8 10" п. н., это означает, что за 1000 — 10 000 циклов репликации случается лишь одна ошибка. Во время полимеризации выбор между правильным и неправильным нуклеотидом осуществляется не только по специфичности водородных связей между комплементарными основаниями в парах, но также по геометрии стандартных А=Т и О=С пар оснований (рис.
25-6). В активном центре ДНК-полимеразы ! могут разместиться только пары оснований с правильной геометрией. Неподходящий нуклеотид может образовать водородные связи с нуклеотидом в матрице, но такая пара обычно не попадает в активный центр фермента. Это позволяет отбраковать неправильное основание до того, как сформируется фосфодиэфирная связь. Однако, чтобы обеспечить высокую степень точности репликации, одной только точности реакции полимеризации недостаточно. Измерения 1и гйгго показали, что ДНК-полимераза вставляет один неправильный нуклеотид на 10з — 10з правильных нуклеотидов. Иногда эти ошибки возникают из-за того, что основание кратковременно находится в нехарактерной таутомерной форме 1см.
рис. 8-9 в т. 1), что позволяет ему образовать вопородные связи не с тем партнером. Число ошибок ья гто уменьшается благодаря дополнительным ферментативным механизмам. Один механизм сокращения числа ошибок свойствен практически всем ДНК- полимеразами и заключается в независимой 3'- 5'-экзонуклеазной активности, благодаря которой каждый нуклеотид после присоелинения проверяется дважды. Эта нуклеазная активность чрезвычайно чувствительна к аномальному спариванию оснований, что позволяет ферменту удалять ошибочно присоединенный пуклеотид !рис.
25-7). Если полимераза присоединила неправильный нуклеотид, происходит ингибирование ее перемещения к позиции, в которой должен присоединяться следующий нуклеотид. Эта пауза создает возможность для исправления ошибки. С помощью 3'- 5'-экзонуклеазной активности полимераза О ~ ~с ."'Т Х 1~ Ь' д с~ Н ф;,»,~ ~ ~ т «ин.~ ~~'"', по ая Ф':а,пеги, Субывденицк ДИН-поюмнерим Ш Е аФ ~Ьм ~ ~ Ъбы.жни ! С ~6ъс,ипицд вв пг.~мн ф~.рч.в~ Л), г йм н ~инн )! ~ (Ь~ю, ~а.~ с>6 .~н иян ~! мамам, мавеаеаммыа ааа амацмацмм реааммацмм в мама мачамч рапммаацав а.
а!!! Чии и и!аьи.июм Ф:~п и:т !а~и !и' и ',:и. ~!м й~ ~ Сенте~ ДИК на лидирующем к оюающей й ' М~' Фф 'Ф Ф Ф Ь~ ~ф ф Ъ' 'Ф .. + [64] Часть 111. 25. Метаболизя ДНК Репликация в зукариотических клетках происходит по похожей схеме, но сложнее Молекулы ДНК в эукариотических клетках значительно крупнее, чем в бактериях, и образуют сложные нуклеопротеиновые структуры (хроматин; разд. 24.3). Основная схема репликации ДНК у эукариот такая же, как у бактерий, и многие белковые комплексы похожи по функциям и структуре. Однако репликация у эукариот регулируется и координируется в соответствии с клеточным циклом, что усложняет процесс. Участки начала репликации достаточно хорошо охарактеризованы у некоторых низших эукариот, но значительно хуже у высших эукариот.
У позвоночных для инициации репликации могут использоваться разные А=Т-богатые последовательности, причем участки начала репликации могут меняться при каждом клсточноьа делении. Репликация дрожжей 5асспагоа(усехсегеих(ае начинается в определенной области, называемой автономно реплицирующейся последовательностью (АРП) или репликатором.
Дрожжевые репликаторы имеют длину примерно 150 п. н. и содержат несколько важных консервативных последовательностей. В 16 хромосомах гаплоидного генома дрожжей рассредоточено около 400 репликаторов. Механизмы регуляции обеспечивают однократную репликацию всей клеточной ДНК в каждом клеточном цикле. Важнук> роль в этой регуляции играют белки, называемые циклинами, и циклин-зависимые киназы (СРК), с которыми они образуют комплексы (с.
660 в т. 1). Циклины быстро разрушаются в результате убиквитинзависимого протеолиза в конце М-фазы (фазы митоза), а отсутствие циклинов способствует организации пререпликативных комплексов (рге- КС) в участках инициации репликапии. В быстро растущих клетках комплекс рге-КС образуется в конце М-фазы. В медленно растущих клетках этот комплекс не образуется до конца фазы О1. Формирование комплексов рге-КС позволяет клетке начать репликацию (этот этап иногда называкп лицензированием). Как н у бактерий, ключевой момент в инициации репликации у всех эукариот — присоединение репликативной хеликазы, гетерогексамерного белкового комплекса МСМ (от англ.
тт(спготохоте та(птепапсе; субъединицы от МСМ2 до МСМ7). Кольцевая хеликаза, состоящая из субъединиц МСМ2 — 7, функционирует подобно бактериальной хеликазс РпаВ и связывается с ДНК при помощи другого комплекса из шести белков, называемого комплексом распознавания точки инициации репликацнн (ОКС; от англ, апрп гесодпй!оп сотр!ех, рис.
25-20), Комплекс ОКС состоит из пяти ААА+ АТРазных доменов и по своил~ функпиям напоминает бактериальный комплекс РпаА. Кроме того, для присоединения комплекса МСМ2-7 необходимы два белка — СРС6 (от англ. се!! г7!г топ сус!е) и СРТ1 (от англ. СРСЮ-г(ерепдепг !гапзспрг !), причем дрожжевой белок СРС6 представляет собой еще одну ААА+ АТРазу, Для осуществления репликации в 5-фазе происходит синтез и активация комплексов циклин — СРК (таких, как комплекс циклин Е— СРК2; см. рис. 12-45 в т.
1) и СРС7 — РВГ4. Оба типа комплексов помогают активизировать реплнкацию путем связывания и фосфорилирования некоторых белков пререгиикативных комплексов. Другис пиклины и СРК ингибируют образование дополнительных рге-КС комплексов после начала репликации. Например, СРК2 связывается с циклином А, когда уровень циклина Е снижается в ходе 5-фазы, что ингибирует активность СРК2 и предотвращает образование дополнительных рге-КС-комплексов. Скорость репликативной вилки у эукариот (около 50 нуклеотидов в секунду) примерно в 20 раз меныне, чем в Е. со!!. Если бы репликация хромосомы человека начиналась в единственной точке инициации репликации, при такой скорости процесса репликапия средней хромосомы продолжалась бы более 500 ч.
На самом деле репликация хромосом человека происходи~ в двух направлениях и начинается во многих точках, удаленных друг от друга на расстояние от 30 до 300 т. п. и. Хромосомы эукариот почти всегда намного длиннее, чем хромосомы бактерий, поэтому наличие многих точек инициации репликации, вероятно, общее свойство клеток эукариот. Как и у бактерий, у эукариот есть несколько типов ДНК-полимераз. Некоторые из них, возможно, выполняют особые функции, например репликацию митохондриальной ДНК, В репликации ядерных хромосом участвует ДНК-полимераза а в комплексе с ДНК-полимеразой б. Субъединичная ДНК-полимераза а имеет похо- %ем смпем репарации ДйК у Е сФ Ф~р» ~~: ~ й.».» 1~'.~».:р~в~ и Р~ Иарвиия Пюдо Р1пжо С'!3~)ИВ,~~!13Н О!.!Ю1ОЯ1!1~ !' ~ .ф ' '. ~,, ~ '„$ .'ф' ~ " ~,3." - '~4, '' Ф Ю,"Т ф ФЙФ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
