Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_3 (1123315), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Удаляли мРНК. 3. Отжигали праймер 2, меченный з'Р, с кДНК и проводили реакцию с ДНК-полимеразой, Анализ экспериментальных данных [153] Нет 18 5 3 3 Протеииаза К Нагреваииедо65 С Нагревание до 85 С Микрококконая нуклеаза 17 (5')...СТСТСТССТТТТССТТСССТСССТТТАТССАССААССАТСССАТАТТТССССААС... Праймер 1: ССТТССТАСССТАТАААССССТТС (5) Праймер рл (5')ССТТСССТСССТТТА дСТР, ЙСТР ЙТТР и ИАТР (дидезокси-АТР; см. Рис, 8-33). 4.Деиатурировали образующиеся дуплексы и разделяли их с помощью электрофореза в полиакриламидиом геле (с. 136 в т. 1).
5. Детектировали меченную "Р ДНК методом авторадио1рафии. Ученые обнаружили, что из модифицированной мРНК образовалась [ззР]ДНК длиной 22 иуклеотида, тогда как из иемодифицированной мРНК образовалась [ззР]ДНК длиной 19 иуклеотидов. б) Используя представленные ниже последовательности, объясните, почему модифицированная и иемодифицироваииая мРНК давали разные продукты. Используя тот же подход для измерения доли траискриптов, подвергающихся редактированию при различных условиях, исследователи обнаружили, что в экстрактах культуры эпителиальиых клеток (так называемых клеток Не(.а) происходит активное редактирование мРНК. Для изучения механизмов этого процесса ученые приготовили активный экстракт клеток Не(.а, как описано в таблице, и определяли его способность модифицировать мРНК рецептора АМРА.
Протеииаза К расщепляет только белки, а микрококковая иуклеаза — только ДН К. Образец Предобработке Доля редзктнроненноб мрик,% в) Используйте эти данные для доказательства того, что в процессах редактирования мРНК принимают участие белки. В чем заключается наиболее слабое место этого доказательства? Для точной идентификации редактированного основания Рютер с коллегами использовали описанную ниже процедуру. 1. Синтезировали мРНК, добавляя в реакционную смесь [а-з'Р]АТР 2. Модифицировали меченую мРНК путем инкубации с экстрактом клеток Не|а. 3.
Гидролизовали модифицированную мРНК до отдельных иуклеотидмоиофосфатов с помощью иуклеазы Р1. 4. Разделяли иуклеотидмонофосфаты методом тоикослойиой хроматографии (см. Рис. 10-24 в т. 1). 5. Идентифицировали образующиеся ззР-меченые иуклеотидмоиофосфаты методом авторадиографии. В неизмененной мРНК исследователи обнаружили только [з'Р]АМР, а в модифицированной мРНК содержался главным образом [ззр]АМР, ио также некоторое количество [ззР]1МР (инозиимоиофосфат, см.
рис. 22-34 в т. 2). г) Почему в этом эксперименте использовали [а-ззР]АТР, а ие [р-ззР]АТР или [у-ззР]АТР? д) Почему использовали [сг-з'Р]АТР а ие [а-з'Р]СТР [а-з'Р]СТР или [и-ззР]ПТР? е) Как полученные результаты исключают возможность удаления всего иуклеотида А (сахар, основание и фосфат) и его заменены иа иуклеотид 1? Далее исследователи модифицировали мРНК, меченную [2,8-'Н]АТР, и повторили описанную выше процедуру.
Метка зН содержалась лишь в моиоиуклеотидах АМР и 1МР. ~ссм ~ Часть 111. 26. Метаболизи РНК ж) Как этот результат исключает возможность удаления основания А (при сохранении сахарофосфатного остова) при замене на основание 1? Каков в этом случае наиболее вероятный механизм редактирования? з) Как замена остатка А на 1 в мРНК объясняет замену С!и на Агй в белковой последовательности двух форм рецептора АМРА? (Подсказка. См.
рис, 27-8). Литература КпеСег, $. М., Впгпа, С. М., Соос)е, Я. А., МооЬЬег!ее, К, 6 Еспеаопс, К. В. (1995) С)псапсасе гесерсог КЬСА ессссспя сп гйго Ьу епгуспагсс сопгегиоп о1 адепомпе Со Своа)пе. 5аепсв 267,1491-1494. Яопппег, В., К6Иег, М., Бргепяе!, К., 6 ЯееЬпгя, К Н. (1991) КЫА ес)сс)пх гп Ьга)п сопсгоЬ а ссесегпо палс оГюп Яосг ьп я!осапсасе-Касес) сЬаппеЬ. СеЫ 67, 11 — 19. чевидно, что открытия Гарри 1Ноллера] не объясняют, как начала изнь, и не дают ответа на вопрос, что же было до РНК. Но накапливает е больше косвенных доказательств, что на нашей планете была жизнь нас, вот от нее мы и произошли — это факт! — Джеральд Джойс, из комментария в Яс)епсе, 19 Метаболизм белка 27.1.
Генетический код 166 27.2. Синтез белков 178 27.3. Транспорт и расщепление белков 210 елки — конечный продукт большинства информационных метаболических путей. В каждый момент времени клетке требуются тысячи разных белков. Они должны синтезироваться в соответствии с потребностями клетки, доставляться к месту локализации и разрушаться, если в них больше нет нужды. Установление механизма биосинтеза бел- ка, очень сложного жизненно важного процесса, — один из самых замечательных успехов биохимии. У эукариот в синтезе белка участвует более 70 различных рибосомных белков, 20 или более ферментов для активации аминокислот, 10 или более вспомогательных ферментов и других белковых факторов для инициации, элонгации и терминации синтеза полипептидов, около 100 дополнительных ферментов для заключительного процессинга белков и 40 или более типов транспортных и рибосомных РНК.
В целом в синтезе полипептидов задействовано почти 300 разных макромолекул. Многие из этих макромолекул включены в сложные трехмерные структуры рибосом. Значение синтеза белка для клетки можно понять, если оценить клеточные ресурсы, направленные на реализацию этого процесса. На синтез белка может расходоваться до 90% химической энергии, затрачиваемой клеткой на все реакции биосинтеза. В каждой клетке бактерий, архей нли эукариот содержится от нескольких единиц до нескольких тысяч копий многих белков и молекул РНК.
В типичной бактериальной клетке 15 000 рибосом, 100 000 белковых факторов и ферментов, связанных с синтезом белка, и 200 000 молекул тРНК, которые составляют более 35% сухой массы клетки. Несмотря на то что синтез белка — очень сложный процесс, он происходит исключительно быстро. Полипептид из 100 аминокислотных остатков синтезируется в клетке ЕвсйелсЫа сой (при 37 'С) примерно за 5 секунд. Синтез тысяч различных белков в клетке регулируется таким образом, что их количество точно соответствует текущему метаболическому состоянию. Для поддержания необходимого состава и концентрации белков скорости процессов транспорта и расщепления должны соответствовать скорости синтеза. Благодаря многочисленным исследованиям мы постепенно приоткрываем занавес, скрывающий слаженный молекулярный танец, в ходе которого каждый белок занимает свое место в клетке и избирательно разрушается, если он уже не нужен.
В процессе изучения синтеза белка мы открыли мир каталитических молекул РНК, который мог существовать до того, как зародилась жизнь в ее современном виде. Исследователи установили строение бактериальных рибосом, что позволило понять процессы синтеза белка в клетке во всех изумительных подробностях. Что же они обнаружили? Белки синтезируются гигантскими РНК-ферментами! 'и' к керекрываещийся и кеперессрывающиися секесическии кад. В кепе, скриви; кмся;-„;с, синяк ив акай, Ы ! н сн»к«к ! ~ ~ Ь ~ ц ! 1 !Кк; сннкн: а С А р (: Л,': и 1 '1~ рнлюнение влииоиислот в состав полнпептндое в присутствии неретуллрныл лолииеров — РНК !Ь н ~юн.ни; «»н н, и, т«.он 11»" !нн$ 1; ° !нл ', ( н' ~ н., н ~( ! и: Реанции деааминироваиив в редантироваиии РНК, о — ;.; евр"<в< и< адово '.„' « <и « <' ~< '< < ) 17х) Часть 111.
27. Метаболизи белка на 3 — и бчконцах транскриптов. В только что синтезированной (до процессинга) мРНК человека в среднем содержится от 10 до 20 А!п-элементов. Ферменты АРАК связываются только с двухцепочечной РНК и осуществляют замену А на 1. Наличие множества А1п-элементов предоставляет большие возможности для внутримолекулярного спаривания оснований в транскрпптах, обеспечивая необходимые для действия АРАК дуплексы.
Иногда модификации изменяют кодирующие последовательности генов. Нарушения функции АРАК бывают связаны с различными неврологическими состояниями, включая латеральный амиотрофический склероз (болезнь Шарко), эпилепсию и клиническую депрессию. Геномы позвоночных содержат множество 51)ЧЕ-элементов, причем у большинства организмов много разных типов 6!ХЕ. А!п-элементы преоблада1от только у приматов.
Детальный анализ генов и транскриптов показывает, что у людей замена А па 1 происходит в 30 — 40 раз чаше, чем у мь1шей, в значительной степени благодаря присутствию многочисленных А!и-злементов. Сравнительно частые замены А на 1, а также распространенность альтернативного сплайсинга (см. рис. 26-22) — две особенности, отличающие геномы приматов от геномов других млекопитающих. Пока неясно, случайно ли произошли эти изменения или они играли важную роль в эволюции приматов и, в итоге, в появлении человека. Краткое содержание раздела 27.1 ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД ° Специфическая аминокислотная последовательность белка создается путем трансляции информации, закодированной в мРНК.
Этот процесс происходит на рибосомах. ° Аминокислоты определяются кодонами мРНК, которые представляют собой нуклеотидные триплеты. Для трансляции нужны адаптерные молекулы тРНК, которые распознают кодоны и встраивают аминокислоты в соответствующем порядке в синтезируемый полипептид. ° Последовательности оснований в кодонах были установлены с помощью синтетиче- ских мРН К с известным составом и последо- вательностью. ° Кодон АТ)С указывает начало трансляции, кодоны 1)АА, 1)АС и ПСА являются сигналами окончания синтеза белка. а Генетический код вырожден: почти все аминокислоты кодируются несколькими кодо- нами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
