Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 66
Текст из файла (страница 66)
За денатурацией апамиаглабиааследили с помощью метода иругавага дихраизма (см. рис. 4-9), позволяющего определять число спиральных стру>кур в макрамалекулах. Денатурацию рибануклеа>н А регистрировали па изменениям флуаресценции белка связанным с изменением окружения остатков Тгр. б) Денатурация рибонуклеазы А пад действием гуанидина гиарахларида (00НС!), определенная методом кругового аих1юизма; дисульфидные связи белка сохраняются. спирты или ацетон, а также мочсвииы, гидрохлорида гуаицдипа и детергеитов. Каждый из зтих факторов оказывает сравнительно слабое воздействие в том смысле, что ни одна ковалептиая связь а полипептидиой цепи белка ие разрывается. 4.4 Денатурация и фалдинг белка (209) Действие органических растворителей, мочевины и детергеитов преимущественно заключастся в нарушении гидроф<>биых взаимодействий, обеспечивающих устойчивость сердцевины глобулярпых белков.
Экстремальпыс значения рН изменяют суммарный заряд белка, что вызывает злектростатическое отталкивание различных групп и разрыв некоторых водородных связей. В результате действия перечисленных факторов белок может переходить в денатурированное состояние, и необязательно в одно и то же. Амннокнслотная последовательность определяеттрехмерную структуру Третичная структура глобулярио>о белка определяется сто амипокислотиой послеловательиостью.
Наиболее веским доказательством зтоп> тезиса являются эксперименты по обратимой ипактивации некоторых белков. Некоторые глобуляриыс белки, которые теряют свою пативиую коиформацию под действием тепла, зкстремальиых значений рН или деиатурирующих агентов, ири возвращении к исходным условиям вновь обретают иативиую структуру и биологическую активность.
Этот процесс называют реиатурацией. Классическим примером может служить рсиатурация рибонуклеазы Л, продемонстрированная в 1950-х гг. Кристианом Лифипсеиом. При обработке очищенного препарата рибонуклеазы Л концентрированным раствором моче- вины в присутствии восстановителя фермент полностью депатурирует. Восстаиовитель разрушает четыре дисульфидиые связи в молекуле риб>оиуклеазы с образованием свободных остатков Суз, а мочевипа нарушает стабилизирующие гидрофобиые взаимодействия.
В таких условиях полипептилиая цепь полностью разворачивается, и фермент лишается своей каталитической активности. Если удалить мочевииу и восстановитель, то беспорядочным образом скрученная молекула рибонуклеазы самопроизвольно сворачивается, принимая присущую сй иативиую коиформацию; каталитическая активность фермента восстанавливается (рис. 4-2б). Процесс сворачивания рибонуклеазы настолько точен, что все четыре вцутримолекуляриых дисульфидпых мостика оказываются иа прежних местах.
Математический расчет показывает, что существует 105 способов образования Натиаиая молекула 26 в каталитичееки активном состоянии. | добавление мочевинл~ и мерка~ полглнала 1ти.и>ернювн аег>е>Окала В ие'нктиннОК ок'тоннни, Д>ку.н фняи> К ГНИ.О> ВОГ- е' ГВВОн.нч>ы О н! ВВО Гн >куки>н"л 'к >'>> мн~ Стн | удаление мочевииы и мерканмкетанолв Нативиая молекула в каталитичееки 26 активном состоянии.
Возникли прежние лисульфилиые связи. [216] Чапь1. 4. Трехмернал структура белков дисульфидных мостиков между восемью остатками Суз. Действительно, в присутствии денатурирующих агентов дисульфидные связи образуются абсолютно случайным образом; зто говорит о том, что для правильного распо>южения дисульфидных связей и восстановления нативной конформации необ>ходпмы слабые взаимодействия. Позднее аналогичные результаты были получены с использованием синтезированного химическим путем каталитичсски активного препарата рибонуклеазы А. Подобный эксперимент полностью исключил возлюжпость, что минорные компоненты в очищенном прспа- Рис. 4-2б. Раиатурация развернутой молекулы рибонуклеазы.
Мочевииа вызывает деиатурацию рибоиуклеазьв а меркаптозтанол (НОСНеСН,ЗН) восстанавливает дисульфидиые связи с высвобождением восьми Остатков Суз. В результате реиатурации происходит восстановление исходных дисульфидимх мостиков. рате Апфинссна принимали какое-либо ВВО>нт в рснатурацин белка, и окончательно .К новизна: самопроизвольность процесса фолдипга. Эксперимент, проведенный АОфщю. жм ВПСРВЫЕ ДОКаЗаЛ, ЧтО аМИНОКПСЛОтиаЯ ЩЮН ечО.
тельность полипептидной цепи содержит в .«'. всю информацию, необходимую для фн»>ВЧ>О. вания нативной трехмерной структуры >к~ кяу. лы. Дальнейшие исследования показали, что ле верно лишь для незначительного числа Ок», к многие из которых имеют нс(к>лыпой размер стабильны по своей природе. Но лаже если КО белки имеют тенденцию принимать натвн::пь конформацию, многим для зтого нужна Онпз ленная помощь„о чем мы поговорим далее. Свертывание полипептидной цепи происходит быстро и поэтапно В живых клетках процесс сборки белка из, згз,. ных аминокислот происходит с очень южз ма скоростью. Например, клетка Е, год прп ЗТТ способна синтезировать биологически:ж > иный белок, состоящий из 100 ех»пнвтпст >во остатков, за 5 с. Каким образом .В>РВО >ОВВО, в полипсптидная цепь припп>кает нативную и::",.
формацию? Предположим, что в среднем кв>г.'.вз аминокислотный остаток может находиться в Й различных конформациоппых состояниях; О'. СЮДа НОЛУЧаЕМ, ЧтО ВОЗМОЖНОЕ ЧИСЛО >О»К>е Р а. ционных состояний полипсптидной цепи >В ма 10и"'. Также предположим, что сзхккцющ;мпм>ОВ сворачивание белка проигхолит путем О>уч и. ного перебора всех возможных конформаций же круг каждой одинарной связи в и пп>к пни:,:: В цепи до тех пор, пока не будет найдена;а> кврм биологически активная конформацпя. Если:.:;.
дое конформационное состояние проверяетсл л кратчайшее время (около 10 ю с — период мвкбания молекулы), то проверка всех Оком лз;а вариантов для такого полипептида займет 1 " лет. Таким образом, процесс укладки >:,шж:~. тидной цепи не может осуществляться м»ъ;км проб и ошибок. Должны су>цсствовать кака ю более короткие пути. Впервые внимание Оим' проблеме уделил Сайрус Левинталь в 1968 г., В данное явление иногда называют чпщ>ктк м и Левинталя».
Процесс укладки болыпой >юли>кмп»>вб цепи, безусловно, подчиняется сложным >юьт 4.4 Денатурация и фолдинг белка (211! йвс. 4-27. Ивдель фвлдиига белка. Компьютерная модель фолдмвга участка из 36 аммнокислотиых остатков ввллииа (актмнсвязывающего белка, обнаруженного в яинраворсмнках кишечника). Процесс начинается со скрученной случайным образом пептмдиой цепи, окруженной оболочкой мз 3000 молекул воды. Прм моделировании наиболее вероятных промежуточных стадий свергмваимя учитывали движения полипептмдкой молекулы и влияние оболочки воды.
В данном случае процесс фолдивга протекает за 0,1 мс. нпзмам, и мы до сих пор пе знаем в точности, как же он происходит. Однако интенсивные исследования привели к формулировке нескольких возможных механизмов этого процесса. По одной вз пшотез процесс фолдинга имеет определенную иерархи>о. В первую очередь образуются локальпыс вторичные структуры. Нскоторыс алщпокислотные последовательности легко образуют и-спирали или р-слои в соответствии с теми ограничениями, о которых мы говорили при обсуждении вторичной структуры белка. Ионные взаимодействия с участием заряженных групп, которые часто располагаются рядом в линейной последовательности полипептидной цепи, могут играть важную роль на этих ранних стадиях укладки белка. Затем происходят взаимодействия между более удаленными частями цепи, скажем, две а-спирали могут образовывать супервторичпую структуру.
Этот процесс продолжается до окончательного формирования доменов и всего белка (рис. 4-27). Следует заметить, что белки, в которых доминируют близкис взаимодействия (между основаниял<и, расположенными недалеко друг от друга в полипсптидной испи), обычно сворачиваются быстрее, чем белки с более сложным характером укладки и большим количеством дальних взаимодействий между отдельными фрагментами. В соответствии с другой модсльк> фолдинг начинается со спонтанного перехода полипептида в компактное состояние; действующей силой этого перехода являются гидрофобные взаимодействия между неполярными остатками. В результате подобного «гилрофобного коллапса» некоторые участки молекулы могут организовать соответствующие вторичные структуры, однако значительная часть боковых цепей аминокислотных остатков нс зафиксированы окончательно.
Подобнос состояние полипсптидной цепи называют «расплавленной глобулой». Механизм фолдинга большинства белков, возможно, включает элементы обеих описанных моделей. Вместо топ> чтобы следовать каким-то одним путем, белковые молекулы используют различные пути, ведущие к одной и той же конечной точке. При этом по мере приближения к нативной конформации реализуется целый ряд копформационных состояний, отвечакпцих частично упакованным белковым структурам. С термодинамичсской точки зрения, процесс фсмщип>а можно представить в виде некой «воронки» (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
