Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 62
Текст из файла (страница 62)
не видны в микроскоп. Для изучения таких мелких объектов, как молекулы белка, нужно использовать рентгеновские лучи с ллиной волны от 0,7 до 1,5 А (0,07 — 0,15 нм). Однако нс существует линз, способных собирать рентгеновские лучи дзн получения изображения; в данном случае приходится напрямую изучать дифракционную картину и восстанавливать изображение с помощью математических методов. Объем информации. извлекаемой из данных рсвтгепострукгурного анализа, зависит от упорядоченности структуры обршща. Уже самые первые исследования днфракции фибриллярпых белков волос и шерсти, имеющих достаточно регулярную оргапизапию, позволнэк получить некоторые лажные структурныс парал>етрн.
Олнако пучки фибриллярцых белков не образуют кристаллов: молекулы белка вытянуты параллельно друг другу, по опи пе ориентированы в одном направления. Ьолее детальную информация> о трехмерной структуре молекул белка можно получить только на кристаллических образцах. Кристьч>э>изация белков — зто в векоторол> смысле искусстпо эксперимента, а нс паука и структуры многих белков до сих пор неизвестны по той простой причине, что пока нс удается получить ях в кристаллическом виде. Практики сравнивают выращивание мопокристалла белка с попыткой связать несколько шаров для боулиша с помощью скотча. 4.3 1ретичная и четвертичная структуры белка 11971 Проведение самого рснтгсноструктурного анализа осуществляется в несколько этапов (рис.
1). Кристалл помещая>т между источником рентгеновского излучения и детектором и получая>т регулярзый набор точек, которые называя>тся рефлексами з возникают как результат лифракции пучка рентгеновских лучей на атомах, причем каждый атом в яа>скуле образца вносит свой вклал в расположение халдой точки. С ш>мощьк> математического метода, основанного на преобразовании Фурье, из дифрзкционной картины получают карту электронной >ыстности белка. В данном случае колшьютср выступает в роли «вычислительной линзыл. Затем на огвовзнпи карты электронной плотности созлак>т яодезь структуры белка. Джон Кенлрю обнаружил, что рентгеновская дяфрзктограмма для кристаллического миоглобина (ввделешюго из мышц кашалота) носит сложный харжтер я состоит из 25 000 рефлексов. Компьютерный ша>вз эп>й картины осуществляли поэтапно.
На кажлои этапе разрешение улучшалось, и наконец, к 1959 и бяло определено положение практически всех атояов белка (кроме атомов водорода). Амннокислотцая псследовательность белка, полученная методами хияичегкого аначиаа, совпадала с молекулярной мощлью. С тех пор бьши определены структуры тысяч елков, некоторые из которых имеют гораздо более с>ожвсс строение, чем миоглобин. Окружение атомов и молекул в кристалле, безушозво, отличается от окружения в растворе или в живой к>еткс.
В модели, полученной при анализе кристалла, з1югтранственные и временные параметры структуры щелзяются. Рентген оструктурный анализ гючти н ичсга не говорит о конформациях, которые молекула белка кажет принимать в растворе. На конформацию белка в кристаллическом состоянии, в принципе, могут также охюыва>ь влияние нефизиологическис факторы, такис юг случайные белок-белковые взаимодействия. Позтояу давние структурного анализа кристаллов сравнивают г лзляыми, полученными пру гимн методами (наприяер, методом ЯМР описанным ниже). При этом почти жегдз выясняется, что структура молекулы, определена>л с помощью рентге>юструктурного анализа, соответпвуст функциональной конфорл>апии белка.
Рентгепоарухгурный анализ может успешно применяться для к>)чеаня белков, размеры которых слишком велики дп исследования методом ЯМ Р Метод ядерного ма>иитиого резонанса (ЯМР) Преимущество метода ЯМР состоит в том, что исслеловацне осуществляется в растворе, тогда как рентгепоструктурный анализ применим только к тем объектам, которые удается кристаллизовать.
Кроме того, методом ЯМ Р можно выявить динамические изменения в структуре белка, в том числе конформациопные изменения. фолдинг и взаимодействие с другими молекулами. ЯМР напрямую связан с ориентацией ядерного магнитного момента — квантовомехапической характеристики атомных ядер.
Только некоторые атомы, в том числе 'Н, "С, »1>1, ир и "Р, имеют ялра, лаюпгие сигнал ЯМР. (Все этн атомы имеют спиновос квантовое число >>>>. — Прим. ред.) Ядерный спин созлает магнитный диполь. Если раствор, солержаший макромолекулы одного типа, поместить в сильное постоянное магнитное поле, то диполи выстраиваются в этом поле в одной из двух возможных ориентаций — по направлению (с низким уровнем энергии) или против направления (с высоким уровнем энергии) поля.
Диполи, выстроенные в магнитном поле, облучают пол прнмым у~лом короткими (-1О мкс) эдектромагнитными импульсами подходяп>ей частоты (резонансцой частоты, находящейся в диапазоне радиочастот). Ядра поглощают некоторое количество энергии и переходят в состояние с более высоким уровнем энергии, причем спектр поглощения содержит информация> о типах ядер и окружении, в котором они находятся. Данные многих подобных экспериментов усредняют, добиваясь максимально- 10„0 8,0 6,0 4,0 2,0 О„О -2,0 Химический сдвиг >Н (ррш) Рис, 2.
Одномерный спектр ЯМР гпобина морского червя. Этот белок очень близок по структуре к миоглобину кашалота; оба белка относятся к одному структурному семейству и отвечают за транспорт кислорода. фЩЩЯ о ет ! 1 ! т — ! г ! — ! — — ! о о 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 — 2,0 Химический сдвиг !И (ррш) 10,0 Рис. 3.
Метод двумерной спектроскопии ЯМР для получения трехмерной структуры глобина (того же белка, что использовался для получения спектра на рис. 2). Диагональ двумерного спектра ЯМР эквивалентна одномерному спектру. Пики, лежащие вне диагонали, соответствуют сигналам ЯЭО, возникшим в результате взаимодействия расположенных близко друг от друга атомов 'Н, сигналы которых в одномерном спектре могут быть достаточно удалены друг от друга.
На рисунке (а) идентифицированы два таких взаимодействия; они показаны на рисунке (6) синими линиями (РПВ Ш 1УКГ). Взаимодействие между метильной группой белка и водородом гена изображено с помощью трех линии. Метильная группа быстро вращается, так что все три ее атома водорода вносят одинаковый вклад во взаимодействие и в сигнал ЯМР. Эта информация использована для построения полной трехмерной структуры белка, приведенной на рисунке (в) (РВВ Ш УИЕ). Множественные линии, изображающие полипептидный остов белка демонстрируют серию структур, согласующихся с ограничениями межатомных расстояний, определенными методом ЯМР.
Структурное сходство этого белка с миоглобином (рис. 1) очевидно. На обоих рисунках белки ориентированы одинаковым образом. [128] Часть 1. Ф. Трехмерная структура белков 1 ° °, 4 1 1 "'1 М 1 о о Е с о о ес о й о х и х о го увеличения отношения сигнае/шулс, и получанчт спектр ЯМР такого типа, как показан на рис. 2. Особенно важную роль в методе ЯМР играют сигначы ог атомов 'Н, что связано с их высокой чувствительностью и высоким содержанием в образцах. Однако в случае макромолекул протонный ('Н) спсюр ЯМР может окээаться слишком сложным. Даже небольцссий сслок содержит сотни атомон ' Н, что обычно делает цеявможным анализ одномерного спектра ЯМР Структ)рпмй аначиз белков стал возможен с развитием мююда двумерной сцекграсконии ЯМ Р (рис.
3). Этот метод цозхлчяет определять зависимые от расстояния динольавпочьные юаимодсйствия между спинами сближенных в нрастранстве атомон (измерение ядерного эффекта Оэерхаузера (ЯЭО) в двумерном эксперименте МОЕЯ'), э также снин-спиновыс взаимодействия атомов, связанных лоэачситнсэми связями (метод ТОСЯ' ). Пссчрсюние полной трехмерной структуры ца ссноэании двумерного спектра ЯМР может оказаться счесть трудоемкой задачей. Величины ЯЭО лак>т нскоторун> информацик> о расстояниях между отдельными этомамн, но чтобы использовать эту информацию, кажлнй сигнал необходимо апсести к определенному атому Какие сипсалы ЯЭО соотнстствуют атомам, связанннм коэалсспссылси связями, можно узнать с номосцью дополнительных экспериментов ТОС5 у. Определенные снгначы в ЯЭО-спектре удастся связать с начичисм вторичной структуры белка, такой кьк а-спираль.
Современные мстолы генной инженерии (гл. 9) позно- вой цепи. В табл. 4-3 приведено относительное содержание аминокислотных остатков, входящих в состав сс-слиральньсх участков и участков с р-конформацией, для нескольких небольших глобулярных белков, состоящих из одной полипецтцдной цепи. Каждый из этих белков имеет ырактсрную структуру, адаптированную для выпачнения специфической биологической функции, однако у них есть важные общие свойства. Каждый белок образует компактную структуру, причем пшрофобные боковые цепи орнентироээны внутрь глобулы (подальше от валы), а гцдрофильные боковые цепи расположены на поверхности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
