Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_2 (1123310), страница 102
Текст из файла (страница 102)
Реассоцнацию измеряют по степени связывания с оксиапатнтом; одноннтевая ДНК прочно связывается с оксиапатнтом в отличие от двухнитевой ДНК, которая не связывается. Кривые отражают наличие трех типов последовательностей: высокоповторяющкеся, умеренноповторяющиеся н неповторяющиеся (Агг!йи г". е„занпг!егз б. г., р. !!3, !п й. Р. к!е!!ег е1!., «Мопегп Азрес1з о! Су1оаепе1!сз: Не1егосьгоща1!й !и Мап», Р. К. Яга11апег тег!Оа, 91О11даг1, !972). та.
Генетические Аспекты метдиолизмд. 1 1029 с е а и и и е с о Плавучее пппмнсглпь, г/сме Рис 25.15. Отделение сателлитныт ДНК от основной массы ДНК Вгоаорй11а ьпе1алокоагег дентрифугнроааннем в градиенте плотности СаС1. Пин 1,701 — основнаи полоса ДНК; пики 1,572 и 1,088 — две сателлитные ДНК !Реасосе А, Хм Вгнг!ад В., боЫпттлк Е., Арле!а 11ч 571а1ол С.
Вч ййи1а1еу П уч Со1г! 5рг!Пк Наг- Ьог 5уп1р. ь)иап1. Ню!ч 38, 405, 1973). (рнс. 25.15), имеет приведенную ниже последовательность, повторенную 12Х! О' раз. -А С А А А С Т- -ТОТТТОАФункция сателлитных ДНК до сих пор неинвестна. Они обнарунеиваюгся обычно в центромерных участках хромосом и,могут участвовать!в апаривании и сегрегации хромосом. У мнопгх эукариот большая часть умеренноповторяюшихся последовательностей перемежается неповторяюп1имися последовательностями, аго иногда они расположены тандемно. Так, в хромосоме Х. 1аеота короткие повторяющиеся последовательности длиной 300 пар оснований перемежаются неповторяюшимися последевателвностями длиной прнмерно 1ООО пар оснований.
Функция утсремежаюших умеренноповторяюшихся последовательностей неизвестна, но предполагается, что огуи играют некоторую регуляторную роль н выражении генов (Гом. ниже). Хотя большая часть умеренноповторяюшихся последовательностей перемежается неповторяюшимися последовательностями, е10- которые умеренноповторяюшиеся последовательности расположены тандемно.
Примеры такого тандемного расположения описаны в следующих ~разделах. 1П. мвтлволизм 25.3.6Л. Гены !88 и 285 рибосомиых РНК Повторяющейся единицей в этом расположении является участок, который ври транскрипции дает едвную цепь РНК (транокрипт). Травскрипт подвергается есозрвванию», т. е. расщеплению специфическими нуклеазами с образованием 188 и 288 рибосомных РНК, а также спсйсерный участок ДНК, .который ие транскрибируерся и функции его ненвнестны. мрансариг бируеммй участпсн ерансири- бирцемий пейсер и Р.а» единица единица Эукариотиый геном содержит обычно несколько сотен повторяю- щихся единиц; онн локализованы в области хромосомы, которая образует ядрышко и называется ядро!шковым организатором.
25.3.6.3. Гены транспортных РНК Каждый ген транспортной РНК у Х. 1аеп13 расположен тандем- но л также перемежается опейсером. 25226.4. Гены дли синтеза гастонов В ядрах некоторых видов морских ежей каждый гистоновый ген .повторен ~почти 1000 раз. У этих животных предполагается, что по крайней мере четыре гвстоиовых гена тесно сцеплены друг с другом и такая группа вместе со спейсерной ДНК, положение которой относительно четырех генов неизвестно, образует тандем- но повторяющуюся единицу. 28.3.7. Значение умеренноповторяющихся последовательностей Анализ прокариотных хромосом показывает„ что сючти вся ДНК о хромосоме служит для кодирования белкса. Для эукариот 25.3.6.2. Гсиы 53 рнбосомной РНК 88 РНК травскрибируется не с того гена, который кодирует 188 и 288 рибосомные РНК.
В гаплоидном геноме Х. 1аеИз содержится примерно 2,8.10' копий этого маленького гена. Хотя этн гены расположены во многих местах различных хромосом. каждый учвст<ж содержит много копий, расположенных тандемно и разделенных спейсером, как и гены !8$ и 288 рибосомных РНК. аь Генетические Аспькть! л|еъАволизмА. ! 1ОЗ1 вто не так, у ннх только неповторяющиеся и немногие умеренно- повторяющиеся последовательности трацскрибируются н транслируются. Правдоподобной, во еще непроверенной,моделью |для объяснения роли умерелнаповторявмцихся последовательностей, в частности тех, которые рааположены между неповторяющимися последовательностями, является предположеиие, что они представляют собой участки для связывания регуляторвых |молекул (РНК или белка) ..Основанием для настроения такой модели послужило то, что у различных тнпав клеток в сложном организме должны актнвираваться различные,комбинации генов и апределеея|ый ген может ра~ботать в различных помбинациях.
Если каждая комбинация контролируется одной или более регуляториых молекул, то соответствуюпзий ген должен быть способен отвечать более чем на один регулятор. Следовательно, нодирующие гены должны быть ассоциированы, например, с наборам рецепторных участков, что иллюстрируется следующей диаграммой: поопезоеяюельно с|пь умереннопояюоряющаяся поеюоряюоряся обляс|пь ренепторнье унес|пня 25.4. Манипуляции генетическими элементами 25.4.1. Выделение генов клонированием рекомбинантных молекул ДНК, сконструированных |п т11го Фрагменты ДНК из бактериальной хромосомы могут быть включ ны в ДНК бактериофага путем генетической рекомбинации 1п тгго (равд.
25.9.1). Так!!и образом может быть получена гомо- генная |популяция ДНК для изучения,бакториальных генов. Гомогенность нвляется следствием того, что все,молекулы |в популяции являются прямымн |потомками единственной молекулы ДНК, т. е. ДНК подверглась планированию. Недавно стало возможным включать ш чйго фрагменты ДНК любого происхождения в ДНК бантериофагов или различных бактериальных плазА|ид. Последние являются неболыпимн кольцевымн ДНК (5000 — 10 000 вар оснований), которые, могут .реплицироваться автономно в бактериальной клетке. Образующуюся лрн этом гибридную молекулу ДНК можно затем илонироватып ч|чо. Новая методология,позволяет выделить индивидуальные фрагменты ДНК (ге~и) из любого источника в больших количествах и,в индивидуальном состоянии.
Было разработано несколько методов для конструирования таких гнбри|дмых молекул ДНК. Один из,них показан на рис. 25.16„ н!. лшглволнзм ° — олаттс — е от тало — и расщепление Есо нг- зиаоинелеезой и о ялттс— -- сттля а — е — — сттла плвэмиаиая г! днк т~ сттАА ватто поале1ев щея ило- иироввВатто ~ иию дни огпжиг и сшиввпие дик - лигаэой — — галтто /и — сттллч ъь гибрийизв днн цннттс оттяни где саморазмножающейся молекулой ДНК (вектором) является плазмпда, которая придает устойчивость к антибиотику тетрациклину и благодаря этому позволяет провслить фенотппнческую селекцию клеток, содержащих зту плазмиду.
Кольцевую ДНК плазмиды сначала расщеплягот в одном месте с помощью Есо)т!-эндопуклеазы !табл. 25.3), чтобы образовать концы, которые идентичны н комплементарны: э -СААТТС вЂ” — -С ААТТС- + — СТТААС-- — СТТАА С— к э' ДНК, которая должна быть вклю !сна ~в плазмилу, тоже подвергается расшеплеишо для образования набора аналогичным образом терминированнык фрагментов Этн фрагменты затем отгкнгают в присутствии рас!цепленной плазмнды, причем оии соединяюися за счет комплементариыл концов, после чего между ними па~мыкают ковалентные связи с помощью ДНК-лигазы.
Очевидным тре- Ркс. 2б.!б. Конструирование гп тпго гибридной молекулы ДНК. Плазмндную ДНК. содержащую только один участок расщепления рестрнктазой. к ДНК. подлежащую клонированию, подвергают действию зидонуклеазы Есок!; расщепленные ДНК отжигают н сшивают лигазой, в результате чего образуетск гнбркднав молекула ДНК. ТЗ. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЬ1АБОЛПЗМА. 1 бованием к атому методу является то, чтобы включение фрагмента пе вызывало инактмвацни необходимых свойств вектора, т. е. способности к автономной репликацин и проявлению селектирующего феиотнпа, например устойчивости к тетрацнклину. Метод клонирования был успешно применен к ДНК Х. 1аеиз, обогащенной генами, кодирующими 185 и 285 рнбосомальные РНК, чтобы получить клоннрованные фрагменты тех тандемных участков, гле расположены зти гены (равд.
25.3.6.1). Как правило, селекции специфических генов,,включенных в ДНК, удается лучше всего в том случае, если ген проя!Еляется в клсгк -хозяине Е. сей. Действительно, гибридные молекулы ДНК, содержащие гены ферментов синтеза тр1гптофана у Е. со1! (гл. 26), были выделены путем селекции в клетках, которые после включения гиб*!Ндной ДНК в трнптофановый ауксотроф уже не нужлалнсь больше в три!Птофане для роста. Ген из дрожжей, ко торый «о,пвует один нз ферментов биосннтеза гистнлвна, иммдазолглицерофосфат-дегидратазу (гл. 23), был клонирован н выделен аналогичным образом. Этот последний случай свидетельствует о том, что по крайней мере некоторые последовательности зукариогной ДНК могут быть транскрнбпрованы и транслированы в Е.
сод с достаточной точностью для проявления генетического выражения .и, еле.!овательно, метод может найти широкое применение при клонировании и проявлении генов млекопитающих в простейших бактериальных клетках. 25.4.2. Синтез генов 1п ч1(го Разработка химических методов синтеза коротких (от 8 до 15 остат!Ков) олнгонуклеотидов позволила провести !полный синтез гена, кодирукмцего одну из тнрозинспецнфи шых тРНК Е. со1! (гл. 26). Этот метод„более,подробно описанный в следующей главе, применим для синтеза любого гена, последовательность которого известна. и предоставляет другой аюдход для манипуляции с определенными генетическими влементами.
25.5. Нуклеотидньтй код и структура белков Так как ДНК представляет собой линейную комбинацию нуклеотидов, связанных фосфцдизфирной связью, то закодированная в ДНК генетическая информация должна специфически передаваться последовательностью оснований (сахарофосфатный скелет одинаков ао всей цепи). Ранее были представлены !давныс о том, что за синтез ферментов от1вегст!венны определенные гены. Лналогичные да|нные указывают на то, что гены направляют синтез всех белков вне зависимости от их физиологической функции. Нуклеи- 82 — 1388 иь метАволизм гиовые кислоты растителнных вирусов и басктериофагов проникают :в клетку .без белка оболочки.
Тем ие ~мвнсе вновь образованные вирусные частицы содержат полный комплект белков, а в клетке- .хозяине образуются также все внрусспецифические ферменты (гл. 28). Таким образом, вся информация для синтеза специфических белков содержится в нуклеиновой кислоте. Некоторые люди имеют гемоглобин НЬ8, который при дезокснтенации гораздо менее распворим, чем нормальный гемоглобин (гл. 31).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
