Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_2 (1123310), страница 98
Текст из файла (страница 98)
Реакция заключается в нуклеофпльной атаке 3'-гидроксидной группой праймера по а-фосфору нуклеозпдтрпфосфата с выделением РРБ Кроме затравки абсолютно необходима лсатрис)а, которая направляет фермент при выборе соответствующих нуклеозндтрифосфатов согласно правилам опар1тва~ния нуклеотидов Уотсона — Крика (рве. 25.6). Б связи с этим продукт является точной репликой матрицы. Фермент может каталпзпровать и обратную реакцию — фосфоролиз ДНК, хотя быстрый гплролнз РР, неорганической пирофосфатазой ОБО1дит,к Гмннимуму физиологическое значение обратной реакции. Кроме синтеза н фосфоролнза ДНК-пол1вмераза 1 может также каталнзнровать гндролиз фосфодиэфирной авязн.
При соответствуюгцнх условиях фермент, проявляет две гпдролитичеокие активности: одна гидролнзует ДНК с 3"конца к 5'-концу (3' — ьб'-экзонуклеаза), а вторая гидролизует ДНК с 5'-конца к 3'-конц. (5' — 3'-экзонуклеаза). Нативный фермент можно ратощопить действием протевназ (субтилпзпна или трипсина) с образованном 1012 ць метхволизм «большого» фрагмента (М 76000), который содержит полимеразную и 3' — +б'-экзонуклеазную активности,,я малого фрагмента (М 36 000), содержащего только 5'- 3'-экзонуклеазную активность. Таким образом, ДНК;полимераза 1 содержит,по крайней мере две различные фермептативные активности в одной полипептидной,цепи. Полимораэная и 5' — 3'-экзонуклеазная активности ДНК-поли.
меразы 1 могут работать координироваино, .катализируя одновременно включение нуклеоткда по 3'-концу и удаление нуклеотида с 5'-конца в однонитевом разрыве двуннтевой ДНК. Суммарный эффект такого совместного действия 5' — Зг-полимеразы и 5' — ~-3'-экзонуклеазы — продвижение однонитевого разрыва вдоль молекулы ДНК. Та~кое перемещение разрыва илп «трансляция ник໠— возможный механизм удаления фотопродуктов, таких, как тямнновые дммеры„при репликацин повреждений, возникающих прн ультрафиолетовом облучении ДНК (равд.
25.3.3). Таким же способом может осущесввляться удаление ивицинруюшего фрагмента РНК из вновь синтезированной ДНК (равд. 25.3.2.3). 3' — б'-Экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы 1 опецифичеоьи гидролнзует однонитевые ДНК и,нарушенные неопаренные концы двунитевой ДНК. Эта активность в самом деле каталпзирует удаление неспаренпых нуклеотидов на 3'-,конце с образованием полностью спаренного комплекса праймер — матрица, который больше не является субстратом для действия экзонуклеазы.
Так, 3' — 5'-экзонуклеаза, действуя координированно с полимеразой, может удалять неправильно включенные нуклеотиды (не образующие комплементарную пару с основанием матрицы) и таким путем исправлять ошибки, которые были допущены во время полимерпзации. Данные, полученные при анализе мутантов фага Т4 по гену, коднруюшему индуцируемую фатом ДНК-полимеразу (гл. 28), свидетельствуют в пользу предположения о корректирующей функции 3' — ~-5'-экзонуклеазы при реплнкацип ДНК. Единичная мутация такого рода резко повышает частоту мутаций (гл. 7) по всему геному фага Т4.
По крайней мере в одном случае было показано, что такой мутаторный эффект ДНК-полимеразы является следствием дефекта 3' — э-5'-экзоиуклеазной части мутантного фермента, что свидетельствует о том, что 3' — 5'-экзопуклеаза играет определенную роль в коррекции ошибок при реплпкации ЛНК. В условиях, оптимальных для определения активности ДНК полпмеразы 1, почти вся ДНК-полнмераэная активность могла быть приписана этому ферменту.
Так продолжалось до тех пор, пока не был получен жизнеспособный мутант Е со!1 с сильно пониженным уровнем ДНК полимеразы 1 и были обнаружены и выделены еще две ДНК«полимеразы — П п П1 ДНК-полпмераза П очень похожа на ДНК полимеразу 1 по катализкруемым ими реакциям, но 75, ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЛСПЕКТЫ МЕТЛБОЛНЗМЛ. ! 1О!3 не имеет 5' — «3'-зкзонутклеаэной активности. ДНК-полммераза Н1 гоже похожа на 1 и содержат как 5' — «8'-, так и 3'- 5'чэкзонуклеазные актмвности. Мутанты Е, сой с термолабильной ДНК.полимеразой Ш неспособны расти и реплнцировать ДНК при 42'С, но способны делать это при 30'С, следовательно, этот фермент необходим для репликацин ДНК !и у!То.
У 'некоторых мутантов с поврежденной ДНК- полимеразой 1 также наблюдается нарушение репликацнн ДНК (п у!То (равд. 25.3.2.3). Функции ДНК полимеразы Н до снх пор не описаны. Некоторые овойет~ва ДНК-полнмераз Е. Сой сопоставлены в табл. 25,1. Таблица 25.1 Сопостанлеппе ДНК-полпмераз 1, Н и НН Е со!т и! Свойстве М 130 000 10 15 000 120 000 100 50 110 000 400 1 ООО число молекул па клетку около оборотоа' езункппн полнмернзапнн 5' — т- 3' зкзопуклеазнаа актнпность 3' — 5' 5' — н 3' а чнско нуклсотнлон.
ааполансрнаоаанныа а аннусу на нолскулу есрнснта прн 37'с. б + налнчнс актнаностн -- отсутстанс актнаностн. !Корносрт Л, Сннтса ДНК. Пср. с антл.--Мс Мнр, Га77.! 25.3.2.2. Зуаарпотпческпе ДНк-полпмеразм Эукарнотическне клетки, так же как н клетки Е. сей и других прокариот, содержат неоколько ДНКсполнмераз. Однако в отличие от прокариотнческих эукариотнческие не обладают 3' — +5'- и 5' — «3'-экэоиуклеаэныии активностями. Преобладающий фермскт (от 80 до 90!)(! общего количества) называется а-ДНК-полнмеразой (М 200 000- — 250 000); количество субъединиц еще не установлено. Вторая полнмераза, (1, представлена од~ной полнпептндной цепью (М 45 ООО).
Оба эти фермента локализованы,в ядре. Третья ДНК-полимераза (М 106000) обнаружена в митохондриях, она отличается от а- и ()-ферментов и, вероятно, катализнрует !реплнкацию митохоидрналыюй ДНК. РНК-содержащие онкогенные вирусы (саркомы Роуса, птичьего л!иелобластоза,,тейкел!ии Раушерп, гл. 28) содержат в составе 1014 пь метлъолнзм вирнона уникальную РНК-зависимую ДНК полпмеразу, которую часто, называют обратной транскриптазой. Этот фермент может каталнзпровать синтез ДНК.колян вирусной РНК, .которая далее может интегрировать (встранваться) в хозяйский геном. В таком лровируснож состоянии внрукный генам .может анспресснроваться, что приводит либо к размноженню вируса, либо к образованию опу хелп. Обратная транскрнптаза, выделенная нз вируса атнчьего мкелобластоза, была изучена нанболее:подробно вредя лредставнтелей этого класса ферментов.
Она содержит два атома Хп'+ на молекулу фермента (М 170 000), который состоит нз двух субъеднннц М 105 000 н 65 000 соответственно. Ферментатквная активность сосредоточена ~в пиалой субъеднннце, функция большой субъед11ннцы неизвестны. Вирусная РНК-заввснмая ДНК-полнмераза наиболее сильно отличается от клеточных полнмераз своей способностью попользовать,в качестве,комплекса праймер — в1атрпца,выделенную вв внрнона РНК.
Эта РНК представляет собой 705 комплекс, содержащнй четыре 358-компонента н от 12 до 40 фрагментов РНК с константой седиментацпн 45. Однпм нз ннх является трнптофановая тРНК (гл. 26), которая служит спецнфвчеоквм праймором в этой реакцпн. Обратная транскрпптаза обладает также рпбонуклеаэной активностью, называемой РНазой Н, которая опецнфкчеокя расщепляет РНК а РНК вЂ” ДНКчпгбрнде, спнтезпрующемся лрн действнп этой полнмеразы.
РНК-завнснмая ДНК-полпмераза обнаружена также,в экстрактах нз тканей жмвотных, у которых не показано наличие РНК-содержащнх онкогепных вирусов. Этн ферменты можно отличить от а-, р- н мктохондрнальной ДНКэполжмераз ио нх спосо~бностн попользовать сннтетнчеокне полнрнбонуклеатнлы в качестве матрицы; клеточные ДНК-полнмеразы отличаются от обратных транскрнптаа также тем, что онн ~не могут нопользоаать природные РНК в качестве матриц к не обладают аосоципрованной активностью РНазы Н. 25.3.2Л. Муаьтиферментные компоненты репликации дНК Пол1имернзацня нуклеотндов;всеми известными ДНК-полн~меразамя вдет только ~в яаправленнн от 5' к 3' н абсолютно ~нуждается в праймере со свободной 3'-гндроксн1тпой концевой группой, к которому н прмсоеднняются полнмернзувмые нуклеотиды.
Для того чтобы полностью объяснить полуконсерватнвную реплнкацню молекулы ДНК, необходимо ответить на следующие вопросы: 1) Каким образом одновременно синтезируются две вити лвухннтевого дуплекса ДНК, нмеющне противоположную хнмжческую полярность (3' — мб' для одной цепи н 5'- 3' для другой)? 2) С помощью какого механнзма н~ннцннруется новая цепь ДНК7 Хотя Га Генетические Аспекты ыетАБОлпзх!А.
! !015 этн проблемы еще не решш!ы полностью, !ИО О ннх уже имеется знач!дельная информация. Заключения о сложности процесса репликацн!и были получены прн генетическом анализе репликации ДНК у Е. со(ГГ Этп исследования привела! к обнаружению класса условно-летальных мутантов, у которых нормальная репликация ДНК и, следовательно, рост возможны прн 30'С и невозможны прп 42'С.
Основываясь на данных генетического .картировання (см. выше), эти температурочувствнтельные мутанты ~были отнесены к шесж! отдельным покусам хромосомы Е. со1!', обозначенным Г(лаА„Г(лаВ, Г(лаС, Г(паВ, Г(лаС! и Г(паХ. Г1родукт гена г(паЕ был идентифицирован как ДНК-полпмераза 1Н. Хотя продукты остальных !снов неиз~вестны, предполагается, что продукты генов Г(лаА и с(паС участвуют в инициации репликации хромосом, а остальных генов — в удлинении цепи. Другие белки, кроме тех, которые определяются Г(па-генами, также,,вероятно, необхопимы для репли!кацнн ДНК. ОднГьк! Нз ннх является ДНК связывающий белок, который прочно и специфично связывается с однонитевой ДНК, ио слабо или,вовсе не связынается с двунитевой ДНК. Так как временное плааление участков двуспиральной ДНК происходит и при фнзнологичеокой температуре, особенно на участках, обогащенных тиммном и аленином (Гл. 7), то этот бслок может связываться с такими временно О!пнонптевымн участкамн в составе дуплекса, смещая положение равновесия между адно- и двуспиральным состояниями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
