Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 76
Текст из файла (страница 76)
В аномалыгых условинх концентрация гл1окозы в крови может полаяться; такое повышение— важный признак сахарного диабета. Очевидно, что это повышение ковцеитрацнн может быть связано с аномальным понижением скорости утилизации глюкозы или с повышением скорости ее образования. Правильное применение изотопных методов (равд. 1142.2) позволяет проанализировать тако~о рода проблемы с точки зрения югднвпдуальных скоростей реакций н дает возможность углубленного понимании аномальных ситуаций.
Экглернмснглльные фистулы. С помощью хирургических методов создают фистулы у эксперимснталы1ых жнвотныт; это даст возможность отбирать пробы крови или лимфы, поступающих в определенные органы и выходящих из них, а также собирать секреты, выделяемые на различных отрезках желудочно-кишечного тракта илн желчных протоков.
Использование фистул позволяет научать реакции, осушсстнляемыс отдельным органом плн тканью. Когстгризаг(ия кровеносных согйдоэ. Степень участяя отдельного органа в метаболизис можно оценить путем сравнения химического состава притскающей к нему артериальной крови п отгекающсй венозной крови. А4сгод катетеризации сосудов позволяет также осуществлять отбор проб крови н вводить спецафические вещества в артерпальныи креветок. Этот способ прижизненного исследования соответствует методу псрфузпи нзолироваяного органа (п ч(то, описанной ннжс, и чополняст метод фистул.
Описанные выше экспернментальныс методики включают процедуры, праводикые (п ч(то. Вместе с теч целый рнд исследований метаболизма может производиться )п тйго. Некоторые нз нит описаны ниже. Однако данные, полученные в экспериментах )п Нгго, следует интерпретировать с осторож1юстью. Так извлечение органа или ткана нз нт естественной среды н использование части ггк лгетлволизж органов (см. ниже) для исследования нвлений метаботизма исключает огромное числа регуляторвых воздействий, которые испытывает !и Шчо каждый орган илм ткань.
Теы не л!енсе применение разнообразвых методов !и чйго позволило получить важные сведеннн о метаболичсскнх реакциях в жаном организме. 11.4.2.2. Методы 1п чйжо Перфузия орвана. Используя метод перфузни изолированного органа )п чП- го, можно вводить то нли иное вещество и выяснить нуть его нревра!цения с помощью аяалнза выходящей из органа жидкости. Орган помещают в замкнутую систему, а которой циркулирует соответстнуюшан обогащенная кислородом жидкость под повышенным давлением. В состав циркулирующей среды может входить дефибринированная или цельная кровь, содержащая соответствующий антикоагулянт (гл. 29) нлп эритроциты, суспендированные в растворах физио.
логи!ескв нзотовических соленых смесей, которые должны имитировать нормальную плазму по рН, ионной силе и ионному составу. Этот подход используют прн исследовании печени, сердца, почек и тонкого кишечника; такие опыты способствуют пониманн!о рази этих органов в метаболизме, Результативность перфузин органов в изучении метаболизма сильно возросла после разработки методик, в которых нзотопна меченный метаболнт перфузирустся в течение очень короткого периода, и метаболизм резко останавливают быстрым замораживанием ткани («ледяные тиски»)! таким образом удается выяснить распределение нзотапа среди множества родственных метаболитов в течение нескольких секунд после его введения и через последующие фиксированные интервалы времени. Л1егаболизм тханеемх срезав, пзмельченных препаратов и препаратов разрушенных клеток. В 1912 г.
Варбург начал исследования метаболизма тканевых срезов с использованием манометрической техники. Количественные изменения объема нлн давления газа регистрировались в приборе, предложеиаом ранее Холдеун!ом, Метод Варбурга позволил исследовать»гетаболнзм маленьких фрагментоа определенной ткани или органа путем маиометрического изменения схорости потребления Оз и выделения СО» (дыхательный коэффициент; см.
равд. 1!.1.2). С помощью этого метода можно измерить также скорость утилизации какого-либо питательно!о вещества нли субстрата, добавленного в среду, в которую помещена ткань, и определяют природу и количество ь!етаболитов, образующихся в течение эксперимента. Этот метод получил прил!ененне при работе со срезами ткани, гомогенатамн ткани, препаратами разрушенных клеток нли бегнлетачпыми препаратами (см. ниже).
Исследования культуры ткани. Клетки и ткани могут выращиваться только в среде точно установленного состава. Эта способносп клеток могла быть использована для исследовательской работы главным образом благодаря иыделению и идентификации незаменимых факторов роста. например витаминов н аминокислот. требуюшнхся лля размножения клеток. Метод культуры ткани позво! лает исследовать биохимические процессы в растущих популнциях животных клеток и в ряде последовательных клеточных генераций. В культуре ткани выращено множество различных типов клеток, как нормальных, так и злокачествсввьж, которые принадлежат нескольким видам млекопитающих, а также человеку. Метод культуры тканк также является подходом к изучению распространения вируса в клетках, позволяя исследовать вирусну!о репликацню и химическое изменения, нндуцированные вирусным агентом в клетке хозяина 1п чйго, а также лучше понять сущность опухолевь!х изменений, вызываемых иекоторымн внрусамн.
Исследования с использование.ч микроорганизмов. Микроорганизмы прелставля!от для биохимика возможность работать с простыни живымн формами, удобнымн для лабораторных исследований. Эти низшие формы имеют сравнительно простые потребности для своего роста н развития, онн быстро воснроиз- 1!. ОБЩИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА водятся и обычно могут выращиваться в больших количествах. Мнхрооргаяизмы — хороший источник для получеаия препаратов отдельных ферментов я препаратов разрушенных клеток для изучении метаболических превращений. Нередка микроорганизмы могут использоваться с целью осуществления химических превращений, которые двмику-органику трудно воспроизвести, нли с целью получения соединений, которые ие столь просто синтезировать в лабораторных условиях.
Кроме того, мутантные штаммы мнкроорганизмов можно легко получить в условиях эксперимента. Большой вклад, который внесли исследования с микроорганизмами в наше понимание биохимической генетики, рассмотрен в гл. 25 — 28. Исследования с бескдегоснымп системами. Прв разрыве плазмзтпческой мембраны освобождаются компоненты клетки.
Методом дифференциального Таблица 101 Распределение типичных клеточных компонентов, полученных дифференциальным центрифугнрованием препарата разрушенных клеток печени Величина центГсбсжлсгс «слк для рллделсккк, я Искссогмс фс Гмскслгклкмс фускрсслклк, клк друпю лкхквкссскл ФГлкккк ! 000 — 6000 10 ООΠ— ! 5 600 Обломки клеток; ядра; мембраны Митохондргсн (см, гл. 12) 1О 20 16 ООΠ— 20 000 Лязосомы; фрагменты мнкротрубочек; пероксисомы Микросомы (фрагментированная эндаплазматнческая сеть); рябосомы; мембраны эндоплазматнческой сети; мембраны Гол ьджи Растворимая фракция изи суперватант (цнтозоль) уксллклжс лклккксстк сбсуждлюсш л грслсдуюшлх гллклх.
Синтез нуклеиновых кис- лот (ядра) Перенос электронов; окислительное фосфори- лирование; цикл лимон. ной кислоты; окисление жирных кислот, окисле- ние аминокислот; синтез мочевины; удлинение це- пи жирных кислот Гндролазы; ферменты, образующие н разру- шающие НзОз Синтез белков1 гндро- кснлирующие системы; ЦитохРом Ьс1 гликознл- трансферазы; синтез му- кополнсахарйдов.
фос- фоглицерндов, триапил- глицеринов н стероидов; редукгазы стероидов; фосфатазы Гликолятическая систе- мз; гексозомонофосфат- ный пурги синтез глико- гена, гликогеноляз; син- тез жирных кислот; ка- таболнзм пурннав и пи- рпмндинов; пептядазы; аминоацнлсннтетазы; амииотрансферазы Ш. МЕТАБОЛИЗМ центрифугирования [см. ниже) удается разде~ить неразрушенные клетки, различные клеточные оргаиеллы и субклеточные частицы, что позволяет исслецо. вать их структуру посредством световой, фазана-койтрастной и электронной микроскопии. гистохимическими и цмтахимическнми метолами, а также оценить их метаболический вклад в процессы, совершающиеся в клетке.
Для разрушения клеточных мембран суспензию клеток в соответствующей изотонической среде, например в 0,25 М сахарове, подвергают воздействию ультразвуковых колебаний или обрабатывают клетки а механическом гомогенизаторе, вращение пестика которого производятся вручную или механически; в результате действия на ткань развивающейся при этом силы трения получаются препараты разрушенных клеток, не совсем точно называемые гома«енотами. Эти препараты содержат мало целых клеток и представляют собой суспенэии ядер, митохондрий. микросом, других клеточных органелл и фрагментон плазматических мембран, а также растваримун> фазу цитоплазмы — цитазоль.
При помо>ци лпфференпнального цснтрифугированпя суспепзии разрушспны:г клеток прн низких температурах раздели>от на индивидуальные фракции. В табл. 11.1 представлены типичные фракции, полученные этим методом, и дано распределение нсскочькнх важнейших ферментативных систем и реакционных путей в этих фракциях. 11.4.2.3. Применение изотопных индикаторов Доступность изотопов позволнет метить молекулы для того, чтобы проследить паправлекпс мстаболичесьих превращений спсиифичесиих участков их структур.
Кроме того, метод изотопных индикаторов очень удобен для маркировки специфических участков или активных центров больших молекул, например ферментов Введение метки особенно важное значение приобретает при изучении метаболизма обычных кочпопсптоа организма, за превращением которых. когда опв ввозятся, с помощью других способов невозможно следить, поакольку' онн неотличимы ат таких же молекул, уже присутствующих в тслс животных. Пспачьзованис изотопов открывает вазможности лля таких исси>л"лазаний потому, по хпмичсскнс различия ме кду изотопачи любого данно>о элемента иичто.ьны. а скорости реакцнн изотопных саслпненнй поступим для регистрации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
